用于治疗癌症的替代性格式化的抗间皮素抗体的组合物和用途的制作方法

1.本发明涉及在免疫完好性和免疫阻抑型肿瘤微环境中有效特异性靶向表达间皮素的癌症的治疗性抗体的领域。具体而言，本发明涉及含有基于抗体的药剂的方法、试剂盒和组合物，这些基于抗体的药剂在抑制癌症生长方面具有改善的治疗功效，而与微环境免疫状态无关。


背景技术：

2.肿瘤发生的机制牵涉增强失调的细胞生长的突变基因的组合积聚和使得它们能够在受影响的患者体内存活的免疫逃避机制的生成。细胞免疫(主要是指t细胞介导的免疫)和体液免疫(主要是指抗体介导的免疫)是脊椎动物宿主生物体抵御感染性病原体和失调的宿主细胞的主要机制。在过去几年中，可以克服受阻抑的细胞介导的免疫的免疫检查点抑制剂的使用已经证明了在释放活化的cd8
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t细胞针对肿瘤子集的杀伤中的稳健作用(hodi fs等人n engl j med 363:711-723,2010)。最近的翻译发现已经证实，肿瘤还产生阻抑体液免疫途径的因子，这些因子进而通过诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)、补体介导的细胞毒性(cdc)和调理作用的抗体介导的机制来阻抑肿瘤杀伤作用(vergote i等人j clin oncol 34:2271-2278；kline jb等人j clin oncol 5:15,2018；wang w等人cytogenet genome res 152:169-179,2017；kline jb等人eur j immunol.48:1872-1882,2018；dai s等人plos pathog 9:e1003114,2013；melero i等人nat reviews cancer 7:95-106,2007)。阻抑体液免疫途径的因子抑制临床使用的治疗性抗体的作用，已经报道称这些治疗性抗体会通过adcc和cdc表现出它们的肿瘤杀伤作用，诸如但不限于利妥昔单抗(rituximab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)，以及许多实验抗体(dilillo dj,ravetech jv,cancer immunol res 3:704-713,2015；ruck t等人int j mol sci 16:16414
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16439,2015；pelaia c等人biomed res int 4839230:1-9,2018；zhou x等人oncologist 13:954-966,2008；hsu yf等人mol cancer 9:-8,2010；spiridon ci等人clin cancer res 8:1720-1730,2002；kline jb等人eur j immunol 48:1872-1882,2018；yamashita-kashima y等人clin cancer res 17:5060-5070,2011)。抗体介导的体液免疫应答受抗体和细胞表面抗原接合的协同作用控制。当这种相互作用最佳时，细胞表面结合的抗体与天然杀伤(nk)细胞或树突细胞/髓样细胞/单核细胞(参与adcc的任何细胞在本文件中都称为“免疫效应细胞”)上的fc-γ-活化受体接合。这种接合引发adcc，并与c1q补体起始蛋白接合，经由经典补体cdc途径以及经由吞噬细胞通过调理作用而导致抗体结合的细胞死亡(reuschenbach m等人cancer immunol immunother 58:1535-1544,2009)。体液免疫应答的抑制剂降低治疗性抗体使用这些机制的能力，并进而减小它们的治疗功效(wang w等人cytogenet genome res 152:169-179,2017；kline jb等人eur j immunol 48:1872-1882,2018；felder m等人gyn oncol 152:618-628,2019)。
3.muc16/ca125蛋白(这里称为ca125)通过与siglec家族的负性免疫调节受体结合以阻抑nk细胞活化(belisle ja等人mol cancer 9:1476-4598,2010)，并且通过直接结合igg1、igg3和igm型抗体的子集来阻抑体液免疫应答。与抗体的结合扰乱fc区，使其对于igg1和igg3型抗体与免疫效应细胞上的fc-γ-活化受体fcgr2a(也称为cd32a)和fcgr3a(也称为cd16a)接合不太有效和/或干扰所有三种抗体类别与补体介导蛋白(包括c1q)接合的能力(pantankar ms等人gyncol oncol 99:704-713,2005；kline jb等人oncotarget 8:52045-52060,2017；kline jb等人j.clin.oncol.5:15,2018；wang w等人cytogenet genome res 152:169-179,2017；kline jb等人eur j immunol.48:1872-1882,2018)。这些研究包括其药理学活性依赖于免疫效应机制的实验性抗癌抗体的临床试验。在这些临床研究中，已经发现ca125水平与临床结果相关(vergote i等人j clin oncol 34:2271-2278,2016；nicolaides nc等人cancer biol ther 13:1-22,2018)。在滤泡性淋巴瘤患者中牵涉临床使用的利妥昔单抗抗体的研究中，当ca125水平处于正常范围时，与ca125水平高于正常范围的那些患者相比，观察到5年无进展生存期提高31.4％(prochazka v等人int j hematol 96:58-64,2012)。本领域一直需要开发可在免疫完好性以及免疫阻抑型微环境中有效杀伤肿瘤的药剂。
4.间皮素是由许多肿瘤类型过表达的细胞表面蛋白，这些肿瘤类型包括间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胆管癌、胃癌和子宫内膜癌。已经发现这些肿瘤类型中的几种肿瘤类型具有体液免疫阻抑作用，这潜在地减弱了基于抗体的抗间皮素疗法的功效(rump a等人j biol chem279:9190-9198,2004；hassan r等人cancer immunol 7:20-30,2007；kaneko o等人j biol chem 284:3739-3749,2009；hassan r.lung cancer 68:455-459,2010；kelly rj等人j clin oncol增刊32:61,2014)。具体而言，已经报道称肺癌、卵巢癌、胰腺癌和间皮瘤癌会表达体液免疫阻抑性ca125蛋白(vergote i等人j clin oncol 34:2271-2278,2016；nicolaides nc等人cancer biol ther 13:1-22,2018；liu l,oncotarget.7:5943-5956,2016；cedres s等人clin lung cancer 12:172-179,2011；emoto s等人gastric cancer 15:154-161,2012)。nicolaides等人(2018)报道了使用抗间皮素抗体阿麦妥单抗(amatuximab)加上标准护理在一线间皮瘤的2期临床试验中发现的体液免疫阻抑。在该试验中，ca125升高的用阿麦妥单抗治疗的患者具有比具有低水平的ca125的那些患者更差的无进展生存期(pfs)和总生存期(os)结果，从而支持这样的观点：依赖于体液免疫功能的抗间皮素抗体将在体液免疫阻抑癌症(诸如上文列出的那些)中提供较低临床益处。需要开发新的基于抗体的药剂的替代策略以潜在地克服这种机制并且为患有和未患有体液阻抑癌症的患者提供更宽的治疗选择。本领域需要有效杀伤表现出体液免疫阻抑表型(例如，表达免疫阻抑性ca125蛋白等)的表达间皮素的肿瘤类型以及免疫完好性的那些肿瘤类型的组合物和方法。


技术实现要素：

5.一个实施方案是抗体-药物缀合物(adc)。该抗体-药物缀合物包含抗间皮素抗体，该抗体包含具有seq id no:7-12中所示的氨基酸序列的互补决定区(cdr)。一种此类抗间皮素抗体包含seq id no:1和seq id no:2。adc还包含拓扑异构酶抑制剂。
6.另一个实施方案是采用不结合ca125的抗间皮素抗体作为抗体-药物缀合物(adc)
pab-pnp、phe-lys(trt)-pab、fmoc-phe-lys(trt)-pab、fmoc-phe-lys(trt)-pab-pnp、ala-ala-asn-pab tfa盐、fmoc-ala-ala-asn-pab-pnp、fmoc-gly3-val-cit-pab、fmoc-gly3-val-cit-pab-pnp、py-ds-prp-osu、py-ds-dmbut-osu、py-ds-dmbut-opfp、py-ds-prp-opfp、peg8-三唑-pabc-肽-mc等，它们的化学结构是本领域已知的。
17.在本发明的另一方面，mes-adc化学连接利用非酶可裂解接头，诸如但不限于smcc、mal-ha-osu、mal-二-eg-opfp、mal-三-eg-opfp、mal-四-eg-opfp、n3-二-eg-opfp、n3-三-eg-opfp、n3-四-eg-opfp、ald-bz-osu、ald-二-eg-osu、ald-四-eg-osu、ald-二-eg-opfp、ald-四-eg-opfp、mc-eda、pha-二-eg-opfp、pha-四-eg-opfp等，它们的化学结构是本领域已知的。
18.在本发明的另一方面中，该接头针对以下优化：(a)抗体与细胞毒素缀合；(b)在体循环、器官实质/基质和肿瘤微环境中的稳定性；和/或(c)改善mes-adc对免疫阻抑型肿瘤的杀伤。
19.在本发明的另一方面，细胞毒素与抗间皮素抗体的轻链和重链所含的一个或多个赖氨酸残基连接。一种此类抗体包含seq id no:1和/或seq id no:2中所示的氨基酸序列。
20.在本发明的另一方面，细胞毒素经由转酰胺基作用与seq id:2中所含的重链的c-端连接。
21.本发明的另一方面是一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含seq id no:3和seq id no:2中所示的氨基酸序列，即分别与mes-1轻链和mes-1重链融合的单链抗cd3。该双特异性抗体能够杀伤免疫活性以及免疫阻抑型表达间皮素的癌细胞。单链抗cd3抗体识别在cd3
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和/或cd8
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淋巴细胞上表达的细胞表面抗原。该双特异性抗体在本文中称为mes-bsp，即靶向间皮素的双特异性抗体。
22.本发明的另一方面是靶向间皮素的双特异性抗体，其中该抗体不被ca125免疫阻抑性蛋白结合。一种此类抗体包含seq id no:3和seq id no:2的氨基酸序列。该双特异性抗体可用于治疗表达间皮素的癌症或与间皮素表达相关的其他疾病。
23.本发明的另一方面是含有一种或多种哺乳动物表达载体的稳定细胞系，该表达载体具有编码seq id no:19[mes轻链cdna]和seq id no:5[mes重链cdna]中所示的抗体的核苷酸序列，该抗体与第二抗体遗传连接。
[0024]
本发明的另一方面是治疗具有表达间皮素的癌细胞的患者的方法，与健康人群相比该患者也表达升高水平的ca125。将mes-bsp抗体施用于患者。mes-bsp抗体由氨基酸序列seq id no:3和seq id no:2组成；双特异性抗体识别间皮素以及人cd3蛋白。
[0025]
本发明的另一方面是治疗具有表达间皮素的癌细胞的患者的方法，与健康人群相比该患者也表达升高水平的ca125。将mes-bsp抗体施用于患者。mes-bsp抗体包含氨基酸序列seq id no:1和seq id no:2以及可识别人cd8蛋白的抗体。
[0026]
在本发明的再另一方面，包含seq id no:1的氨基酸序列和seq id no:2的氨基酸序列的抗体与包含seq id no:6的氨基酸序列的单链抗体融合，该单链抗体与人igg1轻链(seq id no:1)的n端和/或igg重链(seq id:2)的n端融合，产生能够结合间皮素(entrez基因id：10232)和cd3ε(cd3e)蛋白(entrez基因id：916)的双特异性抗体，本文称为mes-bsp。
[0027]
在本发明的另一方面，经由接头拴系的seq id no:1的氨基酸序列和seq id no:6的氨基酸序列的融合产生由seq id no:3与seq id no:2组合组成的轻链融合多肽，以生成
功能性mes-bsp，该功能性mes-bsp可以(a)在存在或不存在ca125的情况下结合靶癌细胞上的间皮素和(b)结合淋巴样细胞上的cd3e，导致靶细胞的杀伤。接头可以是氨基酸、多肽或非生物化学化合物。
[0028]
本发明的再另一方面是mes-bsp，其包含具有seq id no:7、8、9；seq id no:10、11、12；seq id no:13、14、15；和seq id no:16、17、18的氨基酸序列的互补决定区(cdr)，其中在一个或多个cdr内可改变多达3个氨基酸。
[0029]
在本发明的另一方面，seq id no:3中的接头针对以下优化：(a)以igg1重链(seq id no:2)的规范抗体形成和/或(b)改善mes-bsp对免疫阻抑型肿瘤的杀伤，由此该接头包含20种天然存在的氨基酸单元的任何组合以使抗间皮素轻链(seq id no:1)和抗cd3e单链(seq id no:6)的空间距离最大化。
[0030]
在本发明的另一方面，mes-bsp包含与seq id:2的重链的n端遗传连接的抗cd3e单链。该接头针对以下优化：(a)以igg1轻链(seq id no:1)的规范抗体形成和/或(b)改善mes-bsp对免疫阻抑型肿瘤的杀伤，由此该接头包含20种天然存在的氨基酸单元的任何组合以使抗间皮素重链(seq id no:2)和抗cd3e单链(seq id no:6)的空间距离最大化。
[0031]
本发明的另一方面是含有哺乳动物表达载体的稳定细胞系，这些表达载体具有seq id no:5和seq id no:4中所示的，编码mes-1抗体的核苷酸序列，该mes-1抗体与第二抗体遗传连接。
[0032]
本发明的另一方面是具有接枝到兔igg骨架上的seq id no:7-12的cdr氨基酸序列的抗体(这里称为rmes-1)。抗体不被ca125蛋白结合。
[0033]
本发明的另一方面是采用不被ca125结合的抗体监测患者中表达间皮素的肿瘤的方法。使来自患者的体液或组织样品与含有cdr seq id no:7-12的抗体(例如抗体rmes-1)接触。间皮素阳性的患者可以用mes-adc或mes-bsp治疗。
[0034]
本发明的另一方面，提供用于治疗免疫完好性和免疫阻抑性间皮素癌症的试剂盒。该试剂盒包含抗体，该抗体含有优选接枝到啮齿动物igg骨架上的cdr seq id no:7-12。该抗体可用于经由对活检组织的免疫组织化学(ihc)检查或通过对循环肿瘤细胞(ctc)的流式细胞术检查来监测肿瘤的间皮素表达。当检测到阳性信号时，可以用包含与细胞毒素化学连接的seq id no:1和seq id no:2的氨基酸序列的mes-adc对患者进行治疗，并且该细胞毒素可以是拓扑异构酶抑制剂。诊断抗体和治疗抗体都可以在试剂盒中提供。
[0035]
在本发明的另一方面，提供用于治疗免疫完好性和免疫阻抑性间皮素癌症的试剂盒。该试剂盒包含抗体，该抗体含有优先接枝到啮齿动物igg骨架上的根据seq id no:7-12的cdr。该抗体可用于经由对活检组织的ihc检查或通过对循环肿瘤细胞(ctc)的流式细胞术检查来监测肿瘤的间皮素表达。当检测到阳性信号时，可以用由seq id no:2和seq id no:3组成的mes-bsp来治疗患者。诊断抗体和治疗抗体都在试剂盒中提供。
[0036]
本发明的另一方面是mes-adc的用途，其中mes-adc作为单一药剂或与标准护理化学疗法组合施用于其中子集表达ca125的患者。可以经由本领域技术人员使用的方法，使用血清分析或活组织检查确定ca125表达。
[0037]
本发明的另一方面是mes-bsp的用途，其中mes-bsp作为单一药剂或与标准护理化学疗法组合施用于其中子集表达ca125的患者。经由本领域已知的方法，使用血清分析或活组织检查确定ca125表达。
[0038]
在阅读本说明书后本领域技术人员将显而易见的本发明的这些和其他方面提供了与肿瘤微环境的免疫状态无关，用于改善患有表达间皮素的癌症的患者中的治疗应答的方法、组合物和试剂盒。mes-adc和/或mes-bsp药剂在ca125抑制方面的耐受性有助于这种治疗改善。
附图说明
[0039]
图1a.筛选未被免疫阻抑性ca125蛋白结合的抗间皮素抗体；mes-1抗体(seq id no:1和2)的鉴定。简言之，将96孔elisa板用15ku/ml可溶性ca125、1μg/ml重组人间皮素蛋白(作为阳性对照)和1μg/ml人血清白蛋白(hsa)(作为阴性对照)包被并用2.5μg/ml不同的抗间皮素抗体探测以确定它们是否被ca125结合。将孔洗涤并经由抗人或抗啮齿动物fc-辣根过氧化物酶(hrp)缀合的二抗和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)底物检测结合。用0.1n h2so4终止反应，并使用多孔板读数器(varioskan
tm
，thermofisher)在450nm处对孔进行定量。如图所示，由seq id no:1和2组成的抗体mes-1[ab-3(泳道3)]不被ca125结合，而测试的其他四种抗间皮素抗体全部被ca125结合。从一式三份的孔的平均值确定值。使用斯氏t测试(student’s t-test)进行统计分析。图1b.这些结果展示，与那些被ca125结合的抗体(参考图1a的ab-4)对比，未被ca125结合的抗间皮素抗体(参考图1a的ab-3)的摄取增强。为了测量抗体内化，采用phrodo
tm
荧光测定法(thermofisher)，由此将ph敏感性荧光染料缀合至ca125耐受性ab-3(在本文中也称为mes-1)和ca125敏感性ab-4抗体。通过将每种抗体与表达间皮素和膜结合的ca125的人卵巢癌细胞系ovcar3一起孵育来测试抗体的摄取。使用亲本系经由shrna生成同基因ca125敲低系(称为ovcar3-ko)。在24小时过程中在黑色96孔微量培养板中通过在varioskan
tm
板读数器上测量细胞内荧光，重复测量ab-3和ab-4两者的摄取。如图所示，ab-3(mes-1)在两个细胞系中具有相似的摄取，而ab-4在ovcar-ko细胞中具有与ab-3相似的摄取，但在表达ca125的亲本ovcar3中没有，证明与ca125耐受性ab-3对比，ca125对ab-4摄取有负面影响。使用双侧斯氏t测试进行统计学分析。
[0040]
图2a-图2c.检查细胞毒性有效载荷和接头以开发用于最佳杀伤免疫完好性和免疫阻抑型表达间皮素的癌细胞的重新格式化mes-1抗体。图2a提供了各种类型的细胞毒性有效载荷的化学结构(即，微管抑制剂、dna烷化剂、拓扑异构酶抑制剂和蛋白激酶抑制剂，参见，例如，yaghoubi s等人j cell physiol 235:31-64,2019；wang re等人j am chem soc 137:3229-3232,2015)，针对免疫阻抑性和免疫完好性的表达间皮素的靶细胞测试了这些类型的细胞毒性有效载荷。图2b提供了各种酶和非酶可裂解和不可裂解的接头的化学结构，对这些接头进行了测试以生成针对免疫阻抑性和免疫完好性的表达间皮素的靶细胞的mes-adc。图2c提供了潜在adc有效载荷针对表达间皮素的癌细胞或对照细胞系的细胞毒性的概述(表1)。简言之，对96孔组织培养板接种在100μl的rpmi加上7.5％热灭活的胎牛血清(fbs)中的5,000个细胞/孔的间皮素阳性nci-n87(ca125
+
胃癌)、sw1990(ca125
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胰腺癌)、hay(ca125
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间皮瘤)、you(ca125-间皮瘤)、ovcar3(ca125
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卵巢癌)和a549(间皮素阴性肺癌)细胞，和0.0001ng/ml至500ng/ml细胞毒素或阴性对照。将培养物在5％ co2中在37℃处孵育72小时，然后使用结晶紫染色定量活力。使用在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的1％ sds溶解干燥的染色孔，并且在varioskan
tm
多孔板读数器上在570nm处通过比色光密度法定量。测试的几种细胞毒素能够显著地杀伤间皮素靶细胞(与ca125表达无关)以及不表达间皮素的对
照细胞a549和cho(未示出)。如图所示，发现微管抑制剂mmae以及拓扑异构酶抑制剂sn38和pnu159682具有最佳效力，ec50范围为0.008ng/ml至5ng/ml。实验代表最少一式三份的孔。使用双侧斯氏t测试进行统计学分析。
[0041]
图3a-图3c.mes-1和mes-adc组合物、纯化和结构分析。图3a，产生的cho-gs和蛋白a纯化的mes-1抗体的分析。纯化的mes-1的尺寸排阻(sec)hplc分析展示出高度均质性的抗体种类，这是产生具有期望的药物:抗体比率(dar)的均质性抗体药物缀合物的先决条件。图3b提供了使用可裂解接头的sn38-mes-adc和pnu-mes-adc组合物的示意图。图3c，通过疏水相互作用色谱法(hic-hplc)和尺寸排阻色谱法(sec-hplc)确定的sn38-mes-adc和pnu-mes-adc dar均质性。通过mes-1的部分还原和半胱氨酸连接生成两种mes-adc。由hic峰面积和保留时间计算dar。如图所示，sn38-mes-adc和pnu-mes-adc提供了生成具有2-6的期望dar的这两种adc的再现性的代表性曲线。
[0042]
图4a-图4e.mes-adc缀合物格式及体外和体内靶细胞杀伤。图4a，从图2c的游离细胞毒素毒性测定法中观察到的经由含有两种最有效的细胞毒素sn38和pnu159682的mes-adc的靶细胞杀伤。使用可裂解接头生成mes-adc，并测试对表1中列出的各种靶细胞系和对照细胞系的杀伤。如图2c所述进行测定。简言之，96孔组织培养板接种5,000个细胞/孔的间皮素阳性nci-n87、sw1990、hay、you、ovcar3、cho-mes以及作为阴性对照的间皮素阴性a549和cho细胞。将细胞平板接种在100μl的rpmi加上7.5％热灭活胎牛血清(fbs)中，经由有限稀释具有不同的mes-adc浓度(范围从0.01ng/ml至100ng/ml)或平板接种在阴性对照化合物中。将培养物在5％ co2中在37℃处孵育72小时，然后经由结晶紫染色定量活细胞。使用在pbs中的1％ sds溶解干燥的染色孔，并且在varioskan
tm
多孔板读数器上在570nm处通过比色光密度法定量。如图所示，sn38-mes-adc和pnu-mes-adc在表达间皮素的所有靶细胞中都具有最显著的细胞杀伤，与ca125表达状态无关，而间皮素阴性系a549或cho(未示出)未受影响，证明两种adc对表达间皮素的细胞的选择性和效力。我们接下来测试了不同接头格式的前导mes-adc(图4b)。nci-n87和sw1990细胞用作靶细胞，并且pnu-mes-adc用作代表性的mes-adc，用于酶可裂解接头格式或非酶可裂解接头格式的效力分析。如上所述将细胞平板接种，经由有限稀释用不同浓度的每种pnu-mes-adc使细胞生长。如图所示，酶可裂解格式的pnu-mes-adc比非酶可裂解格式的pnu-mes-adc明显更有效(灰线和蓝线)。a549间皮素阴性细胞不受任一adc(未示出)的影响，再次证明mes-adc的效力和靶特异性。图4c：使用rmes-1检测抗体和ca125商业抗体经由ihc针对间皮素表达对nci-n87、sw1990肿瘤细胞系以及一组pdx来源的肿瘤进行筛选，以确保这两种关键蛋白的表达谱在体内得以维持。作为肿瘤片段从异种移植物中取出的nci-n87和sw1990细胞系均维持两种蛋白的表达。在筛选多个样品后，将两个pdx肿瘤片段鉴定为具有相似水平的间皮素表达，由此一个肿瘤片段也表达稳健水平的ca125(间皮瘤#pxf1118)，而另一个肿瘤片段具有不可检测的表达(非小细胞肺癌(nsclc)#lxfa983)。图4d：体内sn38-mes-adc和pnu-mes-adc的测试。首先，将1
×
107个肿瘤细胞注射到多个无胸腺裸鼠的胁腹(对于sw1990细胞而言)或注射到scid小鼠的胁腹(对于n87细胞而言)。在建立可测量的肿瘤病变(》100mm3)后，将小鼠分组并使用可裂解和不可裂解的pnu-mes-adc形式、sn38-mes-adc和pbs(作为阴性对照)测试肿瘤杀伤。如图所示，发现可裂解的sn38-mes-adc和pnu-mes-adc格式在体内明显比非酶可裂解格式(未示出)更有效(上图：sn38-mes-adc在10mg/kg下p《0.049，并且在20mg/kg下p《0.0003；下图：
pnu-mes-adc p《0.011)，反映了体外靶细胞杀伤效果。图4e：针对免疫完好性lxfa983(ca125低)和免疫阻抑型pxf1118(ca125高)pdx来源的肿瘤异种移植物测试可裂解的pnu-mes-adc，以确定针对这些不同肿瘤类型的功效。将肿瘤片段植入无胸腺裸鼠的胁腹，并用pnu-mes-adc或pbs对照处理。如图所示，pnu-mes-adc在杀伤两种肿瘤和引起两种肿瘤的消退方面同样有效，与微环境免疫(ca125表达)状态无关(p《0.012)。实验代表用于体外测定的最少一式三份的孔和用于体内测定的最少五个受试者。使用双侧斯氏t测试进行统计学分析。
[0043]
图5.可裂解pnu-mes-adc对ca125阳性、表达间皮素的pxf1118肿瘤的单次和多次给药和抗肿瘤作用。将肿瘤片段植入无胸腺裸鼠的胁腹并使其生长到平均尺寸为100mm3。将具有相似肿瘤大小集合的小鼠分成4个集合，每个集合6只小鼠，并且在随机分组后第1天、第8天和第15天用pbs、0.25mg/kg pnu-mes-adc或30μg/kg游离pnu159682处理。在随机分组后第1天给予使用0.75mg/kg pnu-mes-adc的第四小组(arm)单剂量，并监测小鼠的肿瘤生长超过50天。如图所示，与用pbs或游离药物处理的小鼠对比，与多剂量pnu-mes-adc处理的小鼠类似，单剂量pnu-mes-adc在杀伤肿瘤和引起肿瘤消退以及维持大于50天的持久应答方面同样有效(p≤0.0061)。实验代表每组六个受试者。使用双侧斯氏t测试进行统计学分析。
[0044]
图6a-图6b.mes-bsp和对照抗体针对免疫阻抑型癌细胞的adcc活性。为了测试mes-bsp免疫介导靶向免疫阻抑型癌细胞的效果，采用了使用原代外周血单核细胞(pbmc)的adcc测定法和jurkat-cd16a adcc报告基因测定法。图6a，测试了mes-bsp、mes-1和抗间皮素meso-ab-4(参考图1a，泳道4)抗体对表达间皮素并产生大量免疫阻抑性ca125蛋白的人ovcar3卵巢癌细胞系的pbmc免疫介导杀伤。简言之，在黑色96孔板中每孔接种10,000个ovcar3细胞，在65μl rpmi加上7.5％胎牛血清和1％ l-谷氨酰胺(r7.5)中过夜。第二天，向每个孔中添加35μl不同浓度的mes-bsp、mes-1和meso-ab-4加上在r7.5培养基中的2.5
×
107个pbmc，并将板在5％ co2中在37℃处孵育72小时。然后将板用250μl r7.5培养基洗涤三次以去除pbmc并且经由cell titer按照制造商的指示(promega)在varioskan
tm
发光板读数器上对粘附性ovcar3靶细胞活力进行定量。如图所示，虽然与meso-ab-4相反，mes-1和mes-bsp抗体两者均显示出肿瘤细胞杀伤，但mes-bsp明显具有最高的靶细胞杀伤，从而证明当利用免疫介导的靶向时，bsp格式的mes-1能够提供比单独的亲本mes-1增强的杀伤。为了确定免疫阻抑性ca125蛋白对adcc活性的影响，将mes-1和meso-ab-4抗体针对ovcar3细胞和如先前所述使用shrna载体trcn0000262686(sigma-aldrich)生成的ovcar3-ca125敲低(ovcar-ko)细胞系(kline jb等人oncotarget 8:52045-52060,2017)及jurkat-cd16a adcc报告细胞系遵循制造商的说明(promega corp)进行测试。jurkat adcc系统采用荧光素酶读数，由此荧光素酶信号强度代表抗体对靶细胞的adcc活性。如图6b中所示，虽然mes-1针对ovcar3具有比meso-ab-4显著更高的adcc活性，但是mes-1和meso-ab-4两者针对ovcar-ko细胞系都具有相似的adcc活性，从而证明呈替代格式mes-1(即adc或bsp)的天然ca125耐受性mes-1亲本抗体作为能够有效杀伤免疫阻抑性肿瘤细胞的药剂的效用。mes-bsp对ovcar3系和ovcar-ko系同样有效。所有实验重复进行三次。使用双侧斯氏t测试进行统计学分析。
[0045]
图7.使用人源化pbmc裸鼠和间皮素阳性、表达ca125的人间皮瘤细胞系在体内测
dil-dap-nrp、boc-n-me-val-val-dil-dap-oh、微管溶素im-1、微管溶素im-2、微管溶素im-3、达沙替尼(dasatinib)、倍癌霉素sa、倍癌霉素tm、倍癌霉素ma、倍癌霉素dm、奈莫柔比星(nemorubicin)、pnu-159682、卡奇霉素(calicheamicin)γ1、n-乙酰基-卡奇霉素γ1、α-鹅膏蕈碱、pbd-二聚体等，它们的结构是本领域已知的。
[0051]
合适的接头包括但不限于安全且优选可生物降解的那些接头。这些接头包括但不限于：val-cit-pab、fmoc-val-cit-pab、fmoc-val-cit-pab-pnp、mc-val-cit-pab-pnp、phe-lys(trt)-pab、fmoc-phe-lys(trt)-pab、fmoc-phe-lys(trt)-pab-pnp、ala-ala-asn-pab tfa盐、fmoc-ala-ala-asn-pab-pnp、fmoc-gly3-val-cit-pab、fmoc-gly3-val-cit-pab-pnp、mac葡糖苷酸酚、py-ds-prp-osu、py-ds-dmbut-osu、py-ds-dmbut-opfp、py-ds-prp-opfp、smcc、mal-ha-osu、mal-二-eg-opfp、mal-三-eg-opfp、mal-四-eg-opfp、ma-peg4-vc-pab-dmae、mc-eda、n3-二-eg-opfp、n3-三-eg-opfp、n3-四-eg-opfp、ald-bz-osu、ald-二-eg-osu、ald-四-eg-osu、ald-二-eg-opfp、ald-四-eg-opfp、pha-二-eg-opfp、pha-四-eg-opfp、peg8-三唑-pabc-肽-mc等，它们的化学结构是本领域已知的。
[0052]
一个实施方案是包含mes-1抗体(seq id no:1和2)的mes-adc，该抗体具有低的ca125结合并且通过ma-peg4-vc-pab-dmae可裂解接头与pnu159682拓扑异构酶抑制剂共价连接。
[0053]
另一个实施方案是包含mes-1抗体(seq id no:1和2)的mes-adc，该抗体具有低的ca125结合并且通过mac葡糖苷酸酚或peg8-三唑-pabc-肽-mc可裂解接头与sn38拓扑异构酶抑制剂共价连接。
[0054]
在另一类抗体格式化中，mes-bsp(双特异性抗体)包含mes-1抗体的免疫球蛋白重链(seq id no:2)和具有低的ca125结合的嵌合轻链(seq id no:3)。嵌合轻链是抗cd3单链抗体(seq id no:6)与mes-1轻链(seq id no:1)融合的遗传融合物(以氨基到羧基的顺序)。抗cd3单链抗体部分经由包含20种已知的天然或经修饰的氨基酸中的任一种的间隔区进行遗传连接，由此接头可以具有将轻链与单链分开的两个或更多个氨基酸，如本领域已知的。期望的接头氨基酸组成和长度可以凭经验确定，以优化在人cd3
+
淋巴细胞的存在下mes-bsp对体外和/或体内间皮素肿瘤细胞杀伤的活性。可以使用本领域已知的多种方法中的任何方法来测定肿瘤细胞活力。
[0055]
对于治疗应用，mes-adc或mes-bsp可作为单一疗法或与标准护理疗法组合施用。
[0056]
组合物可以在进行这些方法的过程中形成。例如，它们可以单独地预先形成和包装并提供给具有要筛选的细胞毒素文库的实体或可以采用不同接头将细胞毒素连接到mes-1抗体的实体。类似地，此处描述的测定和方法的组分可以一起包装在容器中并作为试剂盒出售。试剂盒的组分不必混合在一起，但可以混合在一起。例如，它们可以在单独的容器或分开的容器中提供。这里描述的检测抗体和mes-adc或mes-bsp的任何选择都可以配制为组合物或试剂盒。
[0057]
虽然有几种已知的抗体对ca125免疫阻抑敏感，但这里描述的组合物可用于用mes-adc或mes-bsp治疗患有表达间皮素的癌症的患者，而与肿瘤微环境免疫状态无关。这些组合物中的每一种都具有mes-1亲本序列(seq id no:1-3)中的一个或多个序列，这些序列对ca125结合是耐受的，因此当呈mes-adc格式时在adc内化和杀伤方面有效，或者当呈mes-bsp格式时在免疫相关的杀伤方面有效。
[0058]
在一些情况下，mes-adc可能需要在脂质体中配制以增强其在患有表达间皮素的癌症的患者中的治疗窗口。用于递送mes-adc的任何脂质体制剂都可用于治疗患者。传统的脂质体由一个由阳离子、阴离子或中性(磷酸)脂质和胆固醇组成的脂质双层组成，该脂质双层包围着水体积。脂质体的合适组合物包括但不限于与类脂二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)组合的胍-胆固醇阳离子脂质双(胍)-tren-胆固醇(bgtc)。合适的脂质体制剂的另一个例子是与基于咪唑的辅助脂质mm27结合的氨基糖苷类脂质二油基琥珀酰巴龙霉素(dosp)。脂质体可以空间稳定，例如使用聚乙二醇包被脂质体。
[0059]
我们提供了用于鉴定患有间皮素阳性癌症的患者并用mes-adc或mes-bsp治疗这些患者的组合物、试剂盒和方法。这些方法可包括使用包含cdr seq id no:7-12的ca125耐受性mes-1检测抗体诊断患者肿瘤的间皮素表达的步骤。如果在该测定中为阳性，则可以用与细胞毒素(任选为拓扑异构酶抑制剂)连接的mes-adc(seq id no:1和2)或mes-bsp(seq id no:2和3)治疗肿瘤。诊断步骤和治疗步骤可以是独立的或共同进行的。在间皮素高度过表达的癌症中，此类预筛选的使用可以是任选的。
[0060]
另一个实施方案是含有cdr(seq id no:7-12)的mes-adc，由此这些cdr序列中的任何序列可以单独地或组合地被至多三个氨基酸修饰，只要它们保持ca125耐受性。
[0061]
在另一个实施方案中，mes-adc的细胞毒素是与可裂解接头连接的sn38或pnu159682。接头可以是与sn38连接的peg8-三唑-pabc-肽-mc接头(c h n o)(整个构建体称为sn38-mes-adc-1)、与sn38连接的mac葡糖苷酸酚-接头(整个构建体称为sn38-mes-adc-2)或与pnu159682连接的ma-peg4-vc-pab-dmae接头(整个构建体称为pnu-mes-adc)。
[0062]
在另一个实施方案中，使用由氨基酸ggggs(seq id no:20)组成的氨基酸接头单元将mes-1轻链(seq id no:1)连接至cd3单链(seq id no:6)。接头由一个或多个接头单元组成。作为实例但不限于长度或氨基酸组成，mes-1轻链和抗cd3单链可连接至一个、两个、三个或更多个单元。可通过在cd3
+
淋巴细胞的存在下使用本领域中用于测量肿瘤细胞杀伤的任何方法，如这里所述，通过对间皮素靶细胞的最佳杀伤来确定接头优化。
[0063]
在又一个实施方案中，接头单元包含已知的天然或经修饰的氨基酸的任何组合和可将mes-1轻链与抗cd3单链遗传连接的任何长度，任何组合和任何长度可凭经验测试以优化在具有免疫完好性或免疫阻抑型微环境和人cd3
+
淋巴细胞的间皮素阳性肿瘤中的肿瘤细胞杀伤。
[0064]
另一个实施方案具有含有seq id no:7-18的氨基酸序列的mes-bsp，由此这些序列中的任何序列可以单独地或组合地被至多三个氨基酸修饰，只要它们保持耐受ca125结合。
[0065]
在一些实施方案中，在cd3
+
淋巴细胞的存在下，使用不同的遗传接头，使用功能性方法来优化mes-bsp对杀伤间皮素阳性肿瘤细胞的效果。术语“效应”通常是指当药剂单独孵育时，与cd3
+
淋巴细胞相比，靶细胞杀伤的10％或更大的变化。根据所使用的抗体和药剂，它也可以指与对照相比至少5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的变化。
[0066]
又一个实施方案包括用于筛选抗体药物缀合物(adc)的方法，这些抗体药物缀合物对于它们的药代动力学(pk)、药效学(pd)或药理学(pl)活性，包括细胞内化具有不同的细胞毒素和/或接头。在一些实施方案中，将adc添加到体外细胞中并测试靶细胞杀伤。具有
显著杀伤作用的adc适于治疗测试。同样，根据所使用的抗体和药剂，术语作用可以指与对照相比至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的变化。
[0067]
与所附描述的各个方面相关的各种术语和用语(“术语”)在本文档的整个说明书和权利要求书中使用。除非另有特别说明，否则这些术语将被赋予其在本领域中的普通含义。其他特别定义的术语应以与提供的定义一致的方式解释。
[0068]
如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”也包括复数指代，除非内容另有明确规定。例如，提及“一个细胞”可以包括两个或更多个细胞的组合等。提及“探针”可包括检测抗体、mes-adc、mes-bsp或经由本领域已知的任何分析方法监测肿瘤微环境免疫状态的独立探针。
[0069]
当提及诸如量、时间段和/或类似的量化值时使用的术语“约”意在涵盖从指定值至多
±
9％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中使用的表示试剂的量，诸如分子量、摩尔浓度、反应条件、百分比等的所有值，在所有情况下都应理解为用术语“约”量化。因此，除非指出相反，否则在以下说明书和列出的权利要求书中列出的数值是近似值，可以根据组合物药剂的期望特性和/或通过本发明寻求获得的方法而变化。至少，而不是试图限制本技术的范围，每个数值应该至少由报告的有效数字和通过本领域已知的普通四舍五入方法来取值。
[0070]
所使用的术语“抗体”是广义的，包括免疫球蛋白(也称为“ig”)或抗体分子，其包括多克隆抗体(也称为pab)，单克隆抗体(也称为mab)，包括鼠、人、人源化和嵌合mab，双特异性抗体(也称为bsp)，抗体药物缀合物(也称为adc)，抗体融合免疫毒素和抗体片段。通常，抗体是与特定抗原结合的蛋白质或多肽链。抗原是被给定抗体特异性识别的结构。典型抗体包含异四聚体糖基化蛋白质，由通过二硫键和氢键的复合物排列而成的两条轻链和两条重链组成。术语“其二硫键桥”是指包含在重链铰链区内的二硫键桥，如本领域已知的。每条重链都有一个可变结构域(可变区)(vh)，后面是多个恒定结构域(称为fc结构域)。每条轻链具有可变结构域(vl)和恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链vl与重链的可变结构域对齐。任何种类的抗体轻链基于其恒定结构域内的氨基酸序列，即kappa(κ)和lambda(λ)，被分配到两种不同类型中的一种。
[0071]
术语“单链”是指具有本领域已知的结构的单链抗体。
[0072]
免疫球蛋白轻链(lc)或重链(hc)包含被也称为互补决定区(cdr)的三个“抗原结合位点”中断的“框架”区，这基于报道的序列变异性(wu tt,kabat ea.j exp med 132:211-250,1970)。通常，一个抗原结合位点由六个cdr组成，其中三个位于vh内(cdrh1、cdrh2、cdrh3)，三个位于vl内(cdrl1、cdrl2、cdrl3)(kabat ea等人第5版phs,national institutes of health,bethesda,md.,1991)。
[0073]“特异性结合”或“特异地结合”是指抗体或抗原结合片段与抗原(包括抗体本身所含的序列)的结合具有对齐其他抗原更大的亲和力。通常，特异性抗体或抗原结合片段以约5
×
10-6
m或更小的平衡解离常数kd结合靶抗原。
[0074]“抗体衍生物”或“替代格式”意指如上文定义的通过另一分子的共价附接而修饰的抗体，该共价附接是经由肽化学(即酰胺化等)、遗传融合和/或经由通常不与抗体缔合的翻译后部分(即糖基、乙酰基和/或磷酰基)，等等。
[0075]
术语“抗体动态结构”是指可以影响抗体功能、ca125结合或细胞内化的任何结构变化。
[0076]
术语“单克隆抗体(mab)”是指源自单细胞克隆，包括任何真核或原核细胞克隆或噬菌体克隆，而不是其产生方法的抗体。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，而是还可以包括重组方法。
[0077]“fab结构域”是指本领域已知的抗体铰链二硫键区n端的任何抗体序列。
[0078]“fc结构域”是指本领域已知的抗体铰链二硫键区c端的并包括该抗体铰链二硫键区的任何抗体序列。
[0079]“间皮素”是指间皮素蛋白的整个蛋白或天然改变形式(genbank：aah03512.1)。
[0080]“抗原”是抗体或抗体片段特异性结合的实体。这包括与感兴趣的抗体或蛋白质结合。
[0081]
术语“ca125”是指由muc16基因(hgnc：15582；omim：606154)产生的基因产物，该基因产物以可溶性和膜结合的形式存在。已经报道称它与抗体在fab结构域内结合并影响所结合的抗体的体液免疫功能(kline jb等人oncotarget 8:52045-52060,2017)以及adc摄取。
[0082]
术语“ca125耐受性”是指使用本领域已知的任何方法测量时，与ca125蛋白具有低结合或无结合的抗体。
[0083]
术语“cd3”和“cd3e”是指在人淋巴细胞上表达的cd3-ε蛋白。
[0084]
术语“癌症”、“恶性”、“失调”和“肿瘤”在本领域中是众所周知的并且是指存在具有不受调节的细胞生长和与类似来源的正常细胞类型不同的形态特征的细胞，也称为失调细胞。恶性是指那些能够导致发病和/或死亡的癌细胞。如所使用的，“癌症和肿瘤”包括癌前和恶性类型。
[0085]
如所使用的，术语“可溶的”是指不附着于细胞的细胞膜的蛋白质或非蛋白质药剂。例如，药剂可以从正常或癌细胞脱落、分泌或输出到生物流体中，包括血清、全血、血浆、尿液或细胞的微流体，包括肿瘤。
[0086]
如所使用的，包括ca125的特定蛋白质或非蛋白质药剂的“水平”是指使用本领域已知的用于体外或体内测量蛋白质和/或非蛋白质药剂水平的任何方法确定的药剂的一种或多种水平。此类方法包括凝胶电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(hplc)、薄层色谱(tlc)、超扩散色谱、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、溶液相测定、免疫电泳、western印迹、放射免疫测定(ria)、酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫荧光测定、荧光共振能量转移(fret)、福斯特共振能量转移、电化学发光免疫测定等。在一个实施方案中，ca125的水平使用基于探针的技术来确定，如更详细描述的。
[0087]
术语“体液免疫阻抑或体液免疫阻抑”是指与ca125直接结合并改变其动态结构的任何抗体、抗体片段、双特异性抗体(bsp)或抗体药物缀合物(adc)。已经报道称，ca125，由恶性细胞诸如卵巢癌和间皮瘤产生的(nicolaides nc等人cancer biol ther 19:622-630,2018)以及由来自正常周围上皮细胞的淋巴瘤诱导的(sanusi等人perit dial int.21:495
–
500,2001)，可以结合某些抗体并改变它们的动态结构，从而影响它们的生物活性(包括adcc、cdc、调理作用、内化和/或pk、pd和pl谱)。
[0088]
术语“抗体药物缀合物(adc)”是指与对细胞具有毒性的化学物质、多肽、核酸或放
射性核素缀合或融合的任何抗体。
[0089]
术语“可裂解接头”意指可通过任何常见机制在细胞外或细胞内裂解的化学或氨基酸接头，这些机制诸如但不限于酶或蛋白酶消化、酸降解、ph、化学还原、化学氧化、水解等。
[0090]
术语“不可裂解的接头”意指通常不通过常见机制在细胞外裂解的化学或氨基酸接头，这些机制诸如但不限于酶或蛋白酶消化、化学还原、化学氧化、水解等。
[0091]
术语“酶可裂解的接头”和“酶不可裂解的接头”意指酶或蛋白酶可裂解或不可裂解的接头。
[0092]
术语“双特异性抗体(bsp)”是指可以结合两种或更多种不同抗原的任何抗体。bsp可以包含至少但不限于两种全长抗体、一种全长抗体和一种单链抗体、或两种单链抗体，其中每一种结合不同抗原或同一抗原上的不同表位。
[0093]
术语“规范抗体”是指与免疫球蛋白重链连接的免疫球蛋白轻链，由此该抗体可特异性识别所述抗原。规范抗体可与能够特异性识别第二抗原的另一抗体融合。
[0094]
术语“免疫阻抑型微环境”、“免疫阻抑微环境”、“免疫阻抑型肿瘤微环境”、“免疫阻抑肿瘤微环境”是指产生或表达阻抑细胞或体液免疫功能和活性的因子的肿瘤，这些因子分别诸如但不限于pdl1或ca125。
[0095]
术语“免疫活性微环境”、“有免疫活性的微环境”、“免疫活性肿瘤微环境”、“有免疫活性的肿瘤微环境”、“免疫完好的”、“免疫完好性”、“免疫完好的”是指不产生或不表达阻抑细胞或体液免疫功能或活性的因子的肿瘤。
[0096]“免疫或免疫微环境状态”、“微环境免疫状态”是指确定肿瘤是免疫活性的还是免疫阻抑型。该术语还指产生免疫阻抑性蛋白的肿瘤，其中产生此类蛋白的肿瘤被认为具有免疫阻抑型微环境。
[0097]
术语“抗体依赖性细胞毒性(adcc)”是指一种体外或体内过程，其中抗体可以与细胞表面上的抗原结合，然后经由抗体fc结构域内的序列与免疫效应细胞接合，进而导致它们释放可以杀伤结合的细胞的毒素。
[0098]
术语“补体依赖性细胞毒性(cdc)”是指一种体外或体内过程，其中抗体可以与真核或原核细胞表面上的抗原结合，然后经由抗体fc结构域内的序列与c1q蛋白质接合，进而导致可以杀伤结合的细胞的经典补体级联反应的启动。
[0099]
术语“内化”是指一种过程，其中抗体、抗体片段或adc可以与细胞表面上的抗原结合，然后经由本领域技术人员已知的机制内化。
[0100]
术语“药代动力学(pk)”是指抗体在施用于受试者时保持其稳态浓度的时间。
[0101]
术语“药效学(pd)”是指对基于抗体的药物的生化和生理效应及其作用机制的研究，包括当施用于受试者时它们的作用和效应与其生化结构的相关性。
[0102]
术语“药理学(pl)”是指抗体在体外或体内对控制或杀伤疾病细胞的已知效应。
[0103]
术语“样品”是指从受试者中分离的类似液体、细胞或组织以及存在于受试者体内的液体、细胞或组织的总称。流体可以包括生物流体，其包括与受试者或生物源接触的液体溶液，包括细胞和类器官培养基、尿液、唾液、灌洗液等。
[0104]
如所使用的，术语“对照样品”是指任何临床或非临床相关的对照样品，包括例如来自未患特定癌症类型的健康受试者的样品或不同于其亲代细胞的细胞。
[0105]
术语“对照水平”是指蛋白质或非蛋白质试剂的可接受或预定水平，其用于与源自受试者或用于体外测定的样品中的相同试剂的水平进行比较。
[0106]
如所使用的，治疗性抗体的信号与对照之间的“差异”通常是可以使用本领域常用的统计方法统计确定的任何差异，并且与对照相比，至少有10％或更大的差异。根据所使用的抗体和探针，它也可以指至少5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的变化。
[0107]
术语“抑制”或“其抑制”是指降低统计学上可测量的量，或完全防止。
[0108]
在根据所述方法使用的抗体、含有抗体的部分(即bsp、adc等)的上下文中，术语“功能性”表示抗体能够分别与抗原或ca125结合，和/或能够在体外或体内结合并杀伤靶细胞。
[0109]
术语“靶细胞”是指表达特定抗体或含抗体部分的抗原的真核或原核细胞或细胞群。
[0110]
术语“治疗窗口”意指药物在可控制的耐受毒性剂量内阻抑肿瘤生长的功效。
[0111]
术语“药学上可接受的”是指从药理学和毒理学方面可接受施用于患者并且使用本领域已知的方法制造的物质。这些包括由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物和人类的药剂。术语“药学上相容的成分”是指与抗癌剂一起施用的药学上可接受的稀释剂、佐剂、赋形剂或基质载体。“药学上可接受的载体”是指不干扰一种或多种活性成分的生物活性的有效性并且对宿主无毒的基质。
[0112]
术语“有效量”和“治疗有效”可互换使用，并且在以足以在患者中产生增强的临床结果的量施用药剂的上下文中使用。根据这里描述的方法以“有效方案”施用有效量的药剂。术语“有效方案”是指足以为患有特定癌症的患者实现增强的临床结果的药剂的量和给药频率的组合。当给患者施用能够比亲本化合物更好地克服发病率的药剂或能够增强有效方案的临床结果的药剂时，增强的功效是改善的临床结果。
[0113]
术语“患者”和“受试者”可互换使用，指接受治疗剂治疗的人和其他非人动物，包括兽医受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物。在一个实施方案中，受试者是人。
[0114]“治疗剂”通常基本上不含不希望的污染物。这意味着药剂通常至少约50％w/w(重量/重量)纯并且基本上不含干扰性蛋白质和污染物。
[0115]
术语“免疫效应细胞”是指在与抗体结合的靶细胞结合后可以赋予抗体依赖性细胞毒性(adcc)或吞噬作用(调理作用)的任何细胞，包括但不限于nk、骨髓细胞、单核细胞或树突状细胞。细胞可以被纯化或以混合物形式以外周血单核细胞(pbmc)的形式存在。
[0116]
术语“失调细胞”是指被认为对亲代细胞异常的任何细胞。这些包括转化细胞、恶性细胞、病毒感染细胞、经由自动调节自主生长的细胞或原核病原体。
[0117]
术语“体液应答”是指adcc、cdc、调理作用或抗体通过试验抗体内化到靶细胞中。
[0118]
术语“药剂”是指抗间皮素adc或bsp。
[0119]
术语“显著(地)”是指由包括斯氏t测试在内的任意数量的程序确定的p值小于0.05的统计结果。
[0120]
检测抗体、治疗性mes-adc和mes-bsp的组合物用于治疗患有表达间皮素的癌症的患者的试剂盒和方法
[0121]
本文提供了mes-adc和mes-bsp(两者均称为药剂)和rmes-1(称为检测抗体)的组
合物、试剂盒和用于鉴定此类药剂的方法，此类药剂可以有效地阻抑间皮素阳性癌症，而与它们的微环境免疫状态无关。在这里描述的用于鉴定最佳mes-adc和mes-bsp的方法的一些实施方案中，该方法牵涉鉴定ca125耐受性且可避免其任何负面肿瘤细胞杀伤活性(即，adc的肿瘤摄取、双特异性抗体的免疫应答等)的adc和/或bsp的抗体组分。在其他实施方案中，ca125耐受性mes-adc由两种或更多种经由可裂解或不可裂解接头连接的细胞毒素组成，并且测试mes-adc对表达间皮素的免疫阻抑靶细胞具有显著改善的细胞毒性作用的能力，并且对免疫完好性靶细胞也有效。在一些实施方案中，mes-adc细胞毒素是sn38或pnu159682类的拓扑异构酶抑制剂。在另一个实施方案中，mes-adc包含经由接头mac葡糖苷酸酚或peg8-三唑-pabc-肽-mc以2至6的药物:抗体比(dar)缀合至sn38的mes-1抗体。在又一个实施方案中，mes-adc包含经由接头ma-peg4-vc-pab-dmae以2至6的dar缀合至pnu159682的mes-1抗体。实例示意性地示出于图3b中。试剂盒由mes-adc组成，能够通过采用针对免疫阻抑型和免疫完好性的表达间皮素的肿瘤类型的adc杀伤测定法，经由本领域中使用的筛选测定法来鉴定最佳adc格式(细胞毒素和接头)。另外，试剂盒由最佳mes-adc加上rmes-1检测抗体组成，两者均可在ca125存在或不存在的情况下结合间皮素，以鉴定患有表达间皮素的癌症的患者以用mes-adc治疗，而与肿瘤微环境免疫状态无关。
[0122]
另一个实施方案是用于鉴定最佳mes-bsp的方法。该方法牵涉生成优化的mes-bsp，其中mes-bsp轻链含有seq id no:1中列出的氨基酸或重链具有seq id no:2中列出的氨基酸，在n端连接至抗cd3单链抗体(seq id no:6)。在其他实施方案中，mes-bsp包含经由遗传连接的间隔区与抗cd3单链融合的mes-1轻链。虽然间隔区可以由任何组合和长度的天然或经修饰的氨基酸组成，但是mes-1轻链与cd3单链之间的一个任选连接是通过遗传编码的接头单元“ggggs(seq id no:20)”。连接可以通过一个或多个单元。使用本领域常用的测定法，使用免疫阻抑型和免疫完好性的表达间皮素的靶细胞的功能性杀伤测定法，可以确定最佳间隔区单元。筛选的实例在实施例3中讨论，结果示于图6中。在另一个实施方案中，试剂盒由最佳mes-bsp加上rmes-1检测抗体组成，以鉴定患有表达间皮素的癌症的患者以用mes-bsp治疗，而与肿瘤微环境免疫状态无关。
[0123]
在用于鉴定最佳活性mes-adc或mes-bsp药剂的方法中，将抗体添加到表达间皮素的靶细胞的培养物中，其中靶细胞天然或重组表达免疫阻抑性蛋白。使用标准杀伤测定法监测比较对mes-adc或mes-bsp处理与对照处理的细胞的应答的培养物的靶细胞活力。至少10％的变化通常被认为是有意义的效果。根据所采用的药剂和测定，有意义的效果也可以定义为至少5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的变化。
[0124]
在用于鉴定最佳活性mes-adc或mes-bsp的一些方法中，将药剂添加到表达间皮素的靶细胞的培养物中，其中靶细胞天然表达ca125或外源添加可溶性ca125蛋白。使用标准杀伤测定法监测比较用mes-adc或mes-bsp加上ca125处理的那些与用对照或无ca125的情况下处理的那些的应答的培养物的细胞活力。增强至少10％的杀伤的变化通常被认为是对adcc、cdc和/或adc靶细胞杀伤产生有意义的效果。根据所采用的药剂和测定，有意义的效果也可以定义为至少5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的变化。
[0125]
这里还提供了用抗mes-adc或mes-bsp药剂治疗癌症受试者的方法。例如，患者可
能患有表达间皮素的癌症，诸如但不限于间皮瘤、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌或子宫内膜癌。已经报道称几种抗间皮素抗体会被ca125结合(参考图1)，ca125可扰乱它们作为adc的内化或阻抑它们作为bsp的免疫杀伤作用，使得使用不被ca125结合或影响的mes-adc或mes-bsp成为期望的实体。
[0126]
在用mes-adc或mes-bsp药剂治疗受试者的方法的一些实施方案中，患有表达免疫阻抑性蛋白诸如ca125的癌症，因此使其肿瘤微环境免疫阻抑型患者，可单独用mes-adc或mes-bsp药剂治疗或与标准护理疗法组合治疗。在治疗具有免疫阻抑型微环境的受试者的方法的一些实施方案中，这里描述了已知会表达ca125的表达间皮素的癌症。将mes-adc或mes-bsp药剂施用于受试者，其中受试者具有高于正常范围的基线ca125水平。在这里描述的治疗患有表达ca125的癌症的受试者的方法的一些实施方案中，该方法牵涉单独施用mes-adc或mes-bsp药剂。在又一个实施方案中，mes-adc或mes-bsp药剂与化学疗法组合施用。化学疗法可以是在治疗受试者时被认为是标准护理的任何化学治疗剂或生物剂。在本文描述的治疗方法中，ca125表达水平可以通过本领域已知的任何方式确定并且在本领域中定义为在正常范围内或以上。
[0127]
在其他实施方案中，使用rmes-1检测抗体鉴定患者患有表达间皮素的癌症，并且用mes-adc或mes-bsp药剂治疗那些被rmes阳性结合的癌症，无需确定肿瘤微环境免疫状态，因为mes-adc或mes-bsp在免疫阻抑和免疫完好性微环境中都是有效的。在这里描述的治疗患有表达间皮素的癌症的受试者的方法的一些实施方案中，该方法牵涉单独施用mes-adc或mes-bsp药剂。在又一个实施方案中，mes-adc或mes-bsp药剂与化学疗法组合施用。化学疗法可以是在治疗受试者时被认为是标准护理的任何化学治疗剂或生物剂。
[0128]
在这里描述的治疗方法的一些实施方案中，已知会表达间皮素的示例性癌症包括但不限于间皮瘤、肺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆管癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌，已报道其中许多癌症会产生ca125。
[0129]
本方法可以与其他治疗手段组合，诸如手术(例如减瘤手术)、放射、靶向治疗、化学疗法、免疫疗法、使用生长因子抑制剂或抗血管生成因子。mes-adc或mes-bsp药剂可以同时施用于接受手术、化学疗法或放射疗法治疗的患者。或者，患者可以在mes-adc或mes-bsp药剂施用之前或之后进行手术、化学疗法或放射疗法至少一小时至至多几个月，例如在标准护理疗法施用之前或之后。这里提供的治疗方法的一些实施方案包括除了mes-adc或mes-bsp药剂之外，还向受试者施用治疗有效量的基于铂的化学疗法和/或叶酸抗代谢物和/或parp抑制剂，有或无针对肿瘤特异性抗原或免疫检查点蛋白的抗体。
[0130]
在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，受试者可能已经接受了肿瘤的一线手术切除、基于铂的一线疗法、基于叶酸抗代谢物的一线疗法、基于铂和叶酸抗代谢物的一线疗法、parp抑制剂和/或用于治疗癌症的免疫检查点抑制剂，然后施用mes-adc或mes-bsp药剂。
[0131]
可以通过本领域已知的任何方式根据本文所述的治疗方法施用治疗剂(包括mes-adc或mes-bsp药剂、叶酸抗代谢物、基于铂的化学疗法、parp抑制剂和/或免疫检查点抑制剂)。
[0132]
在又一个实施方案中，可以使用mes-adc或mes-bsp药剂，该药剂包含在seq id no:7-12中所含的cdr序列，根据规范抗体格式外的imgt(国际immunogenetics信息系统)编
号。这些经修饰的mes-adc或mes-bsp药剂的施用可以在任何另外的标准护理治疗的施用之前、同时或之后。治疗可以包括手术以及在治疗时使用的当前标准护理治疗。
[0133]
可以使用各种递送系统来施用治疗剂(包括mes-adc或mes-bsp药剂)，必要时包括皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以例如通过输注或推注，经由全身或局部途径通过上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用药剂。
[0134]
治疗剂可以通过注射器、导管、栓剂或任何可植入基质或设备注射施用。
[0135]
如本文所述使用的治疗剂及其药物组合物可以以任何可接受的剂型口服施用，例如胶囊、片剂、水性混悬剂、溶液等。
[0136]
治疗剂的合适施用方法包括但不限于以适合有效治疗的最终浓度静脉内注射和腹膜内施用。
[0137]
mes-adc或mes-bsp药剂与其他药物组合可以作为药物组合物施用，该药物组合物包含治疗或预防有效量的治疗剂和一种或多种药学上可接受或相容的成分。
[0138]
可以通过标准临床技术来确定在癌症的治疗或预防中有效的治疗剂的量。另外，可以任选地采用体外测定来帮助鉴定mes-adc或mes-bsp药剂所需的最优剂量范围。有效剂量可以从源自基于体外细胞的测定、动物模型或其他非人检测系统的mes-adc或mes-bsp药剂的剂量-应答曲线外推。
[0139]
例如，可以通过确定ld
50
(对50％的人群致死的剂量)和ed
50
(在50％的人群中治疗有效的剂量)值的标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定药剂的毒性和治疗功效。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数或治疗窗口并且可以表示为比率ld
50
/ed
50
。表现出大治疗指数的药剂是合适的。当药剂表现出毒副作用时，可以使用将药剂靶向受影响组织部位的递送系统，以最小化对非间皮素表达细胞的潜在损害，从而减少副作用。或者，如果需要，可以使用诸如但不限于脂质体包封的制剂来改善治疗指数。
[0140]
给药和剂量方案可以根据活性药物浓度而变化，这可取决于受试者的需要。
[0141]
另一个实施方案标记rmes-1检测抗体，用于在表达或不表达ca125的肿瘤中检测表达间皮素的细胞，用于诊断应用以在用mes-adc或mes-bsp药剂治疗期间或之后在体外或原位检测和/或监测表达间皮素的肿瘤细胞的状态。标记可以是本领域已知的用于标记抗体进行诊断监测的任何方法。
[0142]
优化mes-adc和mes-bsp活性的试剂盒的组成
[0143]
本文还提供了用于制备适于杀伤免疫阻抑和免疫完好性的表达间皮素的肿瘤的优化mes-adc和mes-bsp药剂的试剂盒。
[0144]
试剂盒可以包括含有与由seq id no:1和2组成的抗体连接的细胞毒素的mes-adc药剂，该药剂能够杀伤两种或更多种类型的表达间皮素的细胞或肿瘤而与微环境免疫状态无关，其中细胞毒素具有拓扑异构酶抑制活性，ic50≤100μm。
[0145]
试剂盒可以包括含有与抗cd3单链(seq id no:6)连接的具有seq id no:7-12的抗体或抗体片段的mes-bsp药剂，该药剂能够杀伤免疫阻抑型和免疫完好性的表达间皮素的细胞或肿瘤，其中抗间皮素抗体和抗cd3抗体之间的连接是通过优化的间隔区，其导致杀伤表达间皮素的细胞，ic50≤100μg/ml。
[0146]
以上公开内容总体上描述了本发明。本文中公开的所有参考文献明确地通过引用
并入。通过参考以下具体实施例可以获得更完整的理解，这些实施例仅出于说明的目的提供，并不意图限制本发明的范围。
[0147]
实施例1-筛选天然地对免疫阻抑肿瘤产生的蛋白耐受的抗间皮素抗体。
[0148]
几项研究报道称，被ca125结合的抗体在引发体液介导的免疫杀伤以及adc介导的靶细胞杀伤方面受到负面影响(kline jb等人oncotarget8:52045-52060,2017；kline jb等人eur j immunol 48:1872-1882,2018；kline jb等人j clin oncol 5:15,2018；nicolaides nc等人cancer biol ther 13:1-22,2018；nicolaides等人uspto申请1698444)。在鉴定天然不被ca125结合的抗间皮素抗体的尝试中，我们从学术和商业来源(national cancer institute,creative biolabs,novus等)获得了许多抗间皮素抗体，并测试了它们与ca125的结合。图1示出了用于筛选ca125对不同抗间皮素抗体的结合的酶联免疫吸附测定(elisa)的代表性结果。使用重组间皮素作为阳性对照，使用人血清白蛋白(hsa)作为阴性对照。简单地说，将96孔板用50μl/孔的在0.05m碳酸盐缓冲液(ph 9.5)中的15ku/ml人ca125蛋白、1μg/ml间皮素或1μg/ml hsa在4℃处包被过夜。第二天，将板用125ul的0.05m磷酸盐缓冲液(ph7.2)洗涤三次，然后在室温处在含5％牛血清白蛋白的0.05m磷酸盐缓冲液中封闭1小时。然后将孔用125μl的0.05m磷酸盐缓冲液(ph7.2)洗涤三次，并用2.5μg/ml的各种抗间皮素抗体(meso-ab1至meso-ab5)探测。如图1中所示，几种抗间皮素抗体被ca125结合，而由mes-1抗体(seq id no:1和seq id no:2)组成的meso-ab3(泳道3)出乎意料地没有被结合。所有抗体以相似的值结合间皮素蛋白，而没有抗体结合hsa阴性对照。这些结果将mes-1鉴定为天然存在的、ca125耐受性结合抗体，并暗示此类抗体用于治疗产生此类免疫阻抑性因子的癌细胞或肿瘤的用途。为了证实与被ca125 ab-4结合的抗间皮素抗体(图1a)相比，ca125结合差异地影响mes-1(图1a ab-3)的内化，我们使用天然地过表达膜结合的ca125的表达间皮素的ovcar3细胞(kline jb等人oncotarget 8:52045-52060,2017)和ovcar3 ca125敲低系进行内化测定，经由使用如kline等人报道的类似策略产生的shrna生成同基因细胞(称为ovcar-ko)用于比较。使用ph敏感性phrodo荧光染料系统按照制造商的方案(thermofisher,thermofisher.com/adcdiscovery)对两种抗体进行荧光标记。然后将抗体与ovcar3或ovcar-ko细胞在96孔微量培养板中重复孵育24小时，并使用varioskan
tm
板读数器(thermofisher)经由荧光对细胞摄取进行定量。如图1b中所示，与ab-4相比，mes-1ab(ab-3)在表达ca125的ovcar3细胞和ca125敲低的ovcar-ko细胞中都具有有效的摄取，从而支持了这样的意外发现：编码mes-1抗体的序列是天然ca125耐受性的，使其成为使用本文教导的方法治疗表达ca125的肿瘤细胞的合格抗体adc组分。
[0149]
实施例2-能够杀伤免疫阻抑型和免疫完好性的表达间皮素的癌细胞的抗间皮素抗体药物缀合物(adc)的生成
[0150]
为了确定mes-1是否耐受ca125和由表达间皮素的肿瘤细胞产生的潜在其他免疫阻抑性蛋白的免疫阻抑作用，我们将mes-1配置成adc格式并测试其在杀伤表达ca125、免疫阻抑、表达间皮素的癌细胞中的有效性。这里，我们提供了mes-1和mes-adc组合物的生物化学分析以及有效杀伤免疫阻抑和免疫完好性的表达间皮素的肿瘤细胞所需的各种格式的mes-adc的功效的实例。我们提供了与某种有效载荷和某种接头类型连接的ca125非结合抗间皮素抗体(seq id no:1和seq id no:2)最大化杀伤免疫阻抑型靶细胞的用途。如以上所讨论的，nicolaides等人(cancer biol ther 19:622-630,2018；nicolaides等人uspto申
1.39ng/ml)(li c等人mabs 12:1699768,2020)、两种拓扑异构酶抑制剂sn38(平均ec
50 2.44ng/ml)(meyer-losic f等人clin cancer res 14:2145-2155,2008)和pnu159682(平均ec
50 0.014ng/ml)(这里称为pnu)(quintieri l等人clin cancer res 11:1608-1617,2005；carlson rh.oncol times 38:8-10,2016)(图2c)。基于这些结果，我们接下来使用标准的可裂解接头将前导细胞毒素工程改造成adc格式，并针对表1中所示的我们的肿瘤细胞系组重新测试它们。虽然先前的报道已经证实药物:抗体比率(dar)是adc靶细胞杀伤的重要特征，但是当使用部分还原和与游离半胱氨酸的化学连接时，它也是在制造期间有时难以控制的参数(farras m等人mabs.12:1702262,2020)。图3b中提供了sn38-mes-adc和pnu-mes-adc的示意图。许多时候，控制dar再现性是起始抗体结构和纯度所固有的。如图3a中所示，从我们的制造系统纯化mes-1抗体使得我们能够生成均质性起始抗体，并且当部分变性时常规地得到dar为2至4或4至6的adc(图3c)。使用可裂解接头的初步mes-adc的细胞杀伤测定发现，sn38-和pnu-mes-adc显示出对所有表达间皮素的细胞系最有效的靶向杀伤作用，而与ca125状态无关，这可能是由于未扰乱细胞摄取，而不表达间皮素的细胞系未受影响(图4a)。由于pnu-mes-adc显示出最稳健的杀伤活性，我们接下来测试了可裂解格式(ma-peg4-vc-pab-dmae)和非酶可裂解格式(mc-eda)的pnu-mes-adc，并且出乎意料地发现可裂解格式的效力几乎是非酶可裂解格式的100倍(图4b)。
[0155]
为了确定前导mes-adc药剂的体内效力，我们接下来使用表达间皮素和ca125的肿瘤细胞系nci-n87和sw1990以及具有表达间皮素的肿瘤且有和没有ca125表达的患者来源的肿瘤异种移植物(pdx)，在小鼠异种移植模型中测试sn38-mes-adc和pnu-mes-adc可裂解和非酶可裂解格式的治疗功效。为了确认间皮素和ca125在异种移植物和pdx肿瘤中的表达，我们分别使用在兔igg骨架上含有seq id no:7-12的rmes-1检测抗体和商业抗ca125抗体，经由免疫组织化学(ihc)测试异种移植物来源的片段(图4c)。简单地说，切取石蜡包埋的肿瘤片段的5μm切片，然后粘附到载玻片上。将切片脱蜡并制备用于在沸腾的10mm柠檬酸钠ph 6.0中进行抗原提取10分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水-0.05％吐温-20(pbs-t)平衡。然后使用0.3％过氧化物酶/甲醇淬灭切片的内源过氧化物酶活性10分钟，并将切片在pbs-t中的10％山羊血清中封闭1小时。接下来，将载玻片在pbs-t中漂洗，并经由rmes-1或兔抗ca125(novus)使用在封闭缓冲液中稀释的3mg/ml的每种一抗探测间皮素1.5小时，接着洗涤，二次封闭1小时并用5μg/ml抗兔-辣根过氧化物酶(hrp)缀合的二抗封闭1小时。将对照载玻片在没有一抗的情况下孵育。将载玻片在pbs-t中洗涤，然后使用ebioscience
tm
dab高级生色底物如制造商(thermoscientific)推荐的那样暴露。最后，对样品进行苏木精复染，盖上盖玻片并在光学显微镜下分析抗原表达。发现nci-n87和sw1990异种移植肿瘤共表达间皮素和ca125(未示出)，而发现非小细胞肺癌pdx#lxfa983和间皮瘤pdx#pxf1118表达相等水平的间皮素，而仅pdx#pxf118显示出ca125阳性(图4c，上图)。然后我们将这些细胞系用于小鼠cdx(细胞系来源的异种移植物)和pdx(患者来源的异种移植物)体内测定中。
[0156]
对于sw1990胰腺癌cdx模型，将1
×
107个肿瘤细胞注射到多个无胸腺裸鼠的胁腹。将具有已建立的肿瘤(136-154mm3)的小鼠随机分组，并且在植入后第8天、第9天和第10天用10mg/kg或20mg/kg的sn38-mes-adc或用pbs静脉治疗。在第39天sn38-mes-adc治疗与媒介物治疗的组对比，在10mg/kg或20mg/kg处分别使肿瘤生长降低25％或53％，并且差异是统计学显著的(在10mg/kg处p≤0.049；在20mg/kg处p≤0.0003)(图4d，上图)。
[0157]
对于nci-n87胃癌cdx模型，将1
×
107个肿瘤细胞注射到多个scid小鼠的胁腹。将具有已建立的肿瘤(126mm3)的小鼠随机分组并如下所示进行静脉治疗。随机分组后，在第1、8、15、25、32和44天将呈其酶可裂解格式的pnu-mes-adc以0.25mg/kg或0.5mg/kg剂量给药。pnu-mes-adc可裂解格式治疗在0.5mg/kg处使肿瘤生长降低45％，并且差异是统计学显著的(p≤0.050)(图4d，下图)。在相同的nci-n87胃癌cdx模型中，将具有已建立的肿瘤(126mm3)的小鼠随机分组并且在随机分组后第1、3、5、7、9、11、13、15天用sn38-mes-adc以20mg/kg、用pnu-mes-adc非酶可裂解格式(第1天0.625mg/kg、第5天1.25mg/kg、第9天2.5mg/kg、第13天5mg/kg)或用pbs静脉治疗。sn38-mes-adc治疗使肿瘤生长降低48％，并且差异是统计学显著的(p≤0.011)(未示出)。pnu-mes-adc非酶可裂解格式治疗使肿瘤生长降低36％，并且差异是统计学显著的(p≤0.033)，尽管不如具有酶可裂解格式的pnu-mes-adc有效。
[0158]
对于lxfa983 nsclc pdx模型，将肿瘤片段植入多个无胸腺裸鼠的胁腹。将具有已建立的肿瘤(128mm3)的小鼠随机分组，并在随机分组后第1、4、8、12和16天用pnu-mes-adc可裂解格式以0.625mg/kg(第1、4和8天)或0.4mg/kg(第12和16天)，或用pbs静脉治疗。pnu-mes-adc可裂解格式诱导统计学显著的显著肿瘤消退(p≤0.0003)(图4e，上图)。
[0159]
对于pxf1118间皮素pdx模型，将肿瘤片段植入多个无胸腺裸鼠的胁腹。将具有已建立的肿瘤(117-124mm3)的小鼠随机分组，并在随机分组后第1、4、8、12、16和20天用pnu-mes-adc可裂解格式以0.625mg/kg(第1、4和8天)或0.4mg/kg(第12、16和20天)，或用pbs静脉治疗。pnu-mes-adc可裂解格式诱导统计学显著的显著肿瘤消退(p≤0.012)(图4e，下图)。
[0160]
在如上所述的模型设计中使用表达ca125的pxf1118 pdx系进行重复体内实验，以进一步确定减少的和单一的pnu-mes-adc给药的功效。简言之，如上所述制备无胸腺裸鼠并且一旦确认了建立的肿瘤，就分为4组，每组6只小鼠。然后在第1、8和15天用pbs、0.25mg/kg pnu-mes-adc或30μg/kg游离pnu159682(相当于0.25mg/kg pnu-mes-adc剂量中的毒素量)治疗小鼠，或在第1天用0.75mg/kg pnu-mes-adc治疗小鼠一次。跟踪小鼠的肿瘤应答和健康50天以上。如图5中所示，在第49天，与pbs或游离pnu159682(无pn)治疗的小鼠对比，单次剂量的0.75mg/kg可裂解格式的mes-adc足以显著降低已建立的肿瘤生长(p≤0.0061)并维持与每周3次剂量的0.25mg/kg的pnu-mes-adc相似的持久应答，证明了这种格式和组合物用于治疗有或无ca125表达的表达间皮素的肿瘤的功效。药物治疗在所有组中耐受良好。
[0161]
这些数据支持这样的教导：含有可裂解格式的pnu-mes-adc和sn38-mes-adc的物质的组合物能够在免疫阻抑型和免疫完好性肿瘤微环境下有效杀伤肿瘤。其他有效载荷诸如mmae微管抑制剂或接头诸如非酶可裂解的mc-eda不太有效的发现教导，一般使用靶向肿瘤的adc不能简单地克服肿瘤免疫阻抑，而是：1)主动筛选不被免疫阻抑性因子诸如ca125结合的抗体，以及2)筛选最佳有效载荷细胞毒性，和3)筛选最佳接头是开发能够治疗免疫阻抑型和免疫完好性肿瘤的强效和有效adc药剂所需要的，如本文教导的发明中所述。
[0162]
实施例3-能够杀伤免疫阻抑型和免疫完好性的表达间皮素的癌细胞的抗间皮素双特异性抗体(mes-bsp)的生成
[0163]
使用抗体靶向肿瘤细胞通常牵涉阻滞细胞因子与细胞因子受体的结合以阻抑肿瘤细胞生长和/或使用经由adcc、cdc和/或免疫效应细胞调理作用的体液介导的免疫杀伤。
ko细胞系的adcc活性(图6b)。在该测定中，使用jurkat-cd16a adcc报告细胞系，按照制造商的说明(promega corp)经由萤光素酶读数来监测adcc活性。与亲本ovcar细胞相比，先前公布并证实类似系通过受ca125影响的抗体具有显著增强的抗体介导的体液应答(kline jb等人oncotarget 8:52045-52060,2017；nicolaides nc等人cancer biol ther 13:1-22,2018)。最后，为了证明mes-bsp针对表达间皮素的ca125阳性肿瘤细胞的体内功效，我们采用人源化pbmc小鼠模型，其中无胸腺裸鼠植入了表达间皮素和ca125两者的间皮瘤来源的肿瘤细胞。肿瘤建立后，给小鼠植入人外周血单核细胞(pbmc)，接着进行mes-bsp或对照治疗。如图7中所示，mes-bsp能够在统计学上阻抑肿瘤生长，证实了它在治疗ca125免疫阻抑型肿瘤微环境中的表达间皮素的细胞中的效用。在这里，我们教导ca125可能对ca125能够结合的使用免疫介导杀伤的抗体的功效具有显著影响。而且，我们提供了抗间皮素bsp抗体可通过其有效地杀伤免疫阻抑型肿瘤细胞的组合物。
[0166]
表2.序列标识(所有序列均为n到c端)
[0167]
下划线表示抗间皮素定向抗体中的抗体cdr
[0168]
斜体下划线表示抗cd3定向抗体中的cdr
[0169]
粗体表示轻链或重链恒定区
[0170]
粗斜体表示cd3单一轻链和重链之间以及cd3单链和抗间皮素轻链融合物之间的间隔区
[0171]
seq id no:1(mes轻链)
[0172][0173]
seq in no:2(mes重链)
[0174][0175]
seq in no:3(mes-bsp：与mes轻链融合的单链抗cd3)
[0176][0177][0178]
抗cd3 vh在第一ggggs
x
接头之前，并且抗cd3 vl在第一接头和第二接头之间，而抗间皮素vl在第二接头之后。
[0179]
seq id no:4(mes-bsp：与mes轻链融合的单链抗cd3)，经修饰的前导序列加下划线
[0180]
atgtctgtgcctacccaggtgctgggactgctgctgctgtggctgacagacgcccgctgtcaagtgcagttggtggaatcagggggaggagtcgtgcagccgggaagatcattgagactgtcgtgcgcggcgtccggttacaccttcacccggtatactatgcactgggtgcgccaggcccctggcaaatgcctggagtggatcggttacattaacccgagcagggggtacaccaactacaaccagaaggtcaagggccgcttcaccatctcccgggataactccaagaacaccgcatacctccaaatgaactccctgcgggccgaagatacggccgtgtactactgtgcccggtactacgacgaccattactgccttgactactggggccagggcactctggtgactgtgtccagcgggggcggtggaagcggggggggaggctccggaggaggcggatcgggtggcggcggcagcgacatccaaatgacccagtccccgtcctcactttccgcatccgtcggcgatcgcgtgaccattacttgttccgcgtcgtcgtccgtgagctacatgaactggtatcagcagaagccaggaaaggccccgaaactgctgatctacgacacttccaagctggcttctggagtgcccagcagattcagcggatcagggtccggtaccgactacaccttcaccatttcgtccctgcaacccgaagatatcgccacctactactgccagcagtggtcgagcaacccttttacgttcggctgtggcaccaagctcgagatcaaaggtggcggcggtagcgacatccagatgacacaatctccttcatctctcagtgcttccgtaggagatagagttactataacctgtcaagcatctcaaaggatctcttcctatctcagttggtatcaacagaaaccgggaaaagtgcccaaacttcttatctacggtgctagtacacttgcttccggggtcccctcaaggttcagcggcagcggttctggaacagactttaccctgacgatctcaagtctccagccagaagacgtggctacatactactgccagtcttacgcatacttcgatagcaataactggcacgccttcggtggcggaaccaaagttgaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
[0181]
seq id no:5(mes重链)，经修饰的前导序列加下划线
[0182]
atggaatggagctgggtgttcctgttctttctgtccgtgaccacaggcgtgcattctgaagtgcaactcgtggagtcaggcgggggtctggttcagccgggcggcagtcttcggcttagttgtgccgcaagcggctttgacctcgggttttatttctacgcctgttgggtaaggcaggcacctggaaagggtctggaatgggtctcttgcatatatacggcaggtagcggctccacgtattacgcaagttgggccaagggccggttcacaatatctagggacaattccaaaaataccctgtacctgcaaatgaacagtctcagggctgaagacactgctgtctactattgcgctcgctcaacggctaatacccggtccacttattacttgaacctctggggtcagggaactttggtaacagtatcatccgcatccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcttatattcaaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtga
tgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt
[0183]
seq id no:6[抗cd3 hc和lc单链]
[0184][0185]
seq id no:7
[0186]
qasqrissyls
[0187]
seq id no:8
[0188]
gastlas
[0189]
seq id no:9
[0190]
qsyayfdsnnwha
[0191]
seq id no:10
[0192]
gfdlgfyfyac
[0193]
seq id no:11
[0194]
ciytagsgstyyaswakg
[0195]
seq id no:12
[0196]
stantrstyylnl
[0197]
seq id no:13
[0198][0199]
seq id no:14
[0200][0201]
seq id no:15
[0202][0203]
seq id no:16
[0204][0205]
seq id no:17
[0206][0207]
seq id no:18
[0208][0209]
seq id no:19[mes轻链cdna]，经修饰的前导序列加下划线
[0210]
atgtctgtgcctacccaggtgctgggactgctgctgctgtggctgacagacgcccgctgtgacatacagatgactcagtccccttcaagcctcagtgcatcagtaggtgaccgggttaccattacctgccaggccagtcaacgaatatcatcctacctctcctggtaccagcagaagccggggaaggtgcctaagctcttgatctacggcgccagtacgcttgcaagcggggtcccatcacggttctccggtagtggctctggaacagattttacgctcacgatttccagccttcaaccggaggatgttgcgacttactactgtcaatcctatgcgtatttcgattccaataactggcacgcattcggtgggggaaccaaagtggagattaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagc
agcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

技术特征：
1.一种抗体-药物缀合物(adc)，所述抗体-药物缀合物包含抗间皮素抗体和拓扑异构酶抑制剂，所述抗间皮素抗体包含具有如seq id no：7-12中所示的氨基酸的互补决定区(cdr)。2.根据权利要求1所述的adc，其中所述抗体包含seq id no：1和seq id no：2的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的adc，其中所述抗体与所述拓扑异构酶抑制剂共价连接。4.根据权利要求1所述的adc，其中所述抗体通过可裂解接头与拓扑异构酶抑制剂连接。5.根据权利要求4所述的adc，所述adc被封装在脂质体中。6.根据权利要求3所述的adc，其中所述拓扑异构酶抑制剂是(2s，4s)-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1s，3r，4as，9s，9ar，10as)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1h-吡喃并[4
′
，3
′
：4，5][1，3]唑并[2，3-c][1，4]嗪-3-基]氧基}-6，11-二氧代-1，2，3，4，6，11-六氢并四苯-2-甲酸(pnu159682)。7.根据权利要求6所述的adc，其中pnu159682经由接头马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酰氧基羰基(ma-peg4-vc-pab-dmae)与所述抗间皮素抗体共价连接。8.根据权利要求7所述的adc，其中所述接头与所述抗间皮素抗体中的半胱氨酸连接。9.根据权利要求7所述的adc，其中所述抗体包含seq id no：1和seq id no：2的氨基酸序列。10.根据权利要求9所述的adc，其中所述adc的dar在2和6之间，包括端值在内。11.根据权利要求7所述的adc，其中所述拓扑异构酶抑制剂是(2s，3s，4s，5r，6s)-6-[[(19s)-10，19-二乙基-19-羟基-14，18-二氧代-17-氧杂-3，13-二氮杂五环[11.8.0.02，11.04，9.015，20]二十一碳-1(21)，2，4(9)，5，7，10，15(20)-七烯-7-基]氧基]-3，4，5-三羟烷-2-甲酸(sn38)。12.根据权利要求11所述的adc，其中sn38经由接头甲基(2s，3s，4s，5r，6s)-3，4，5-三乙酰氧基-6-[2-氨基-4-(羟甲基)苯氧基]烷-2-甲酸酯(mac-葡糖苷酸)与所述抗间皮素抗体共价连接。13.根据权利要求11所述的adc，其中sn38经由接头peg8三唑-pabc-肽-mc与所述抗间皮素抗体共价连接。14.根据权利要求11所述的adc，其中sn38与所述抗间皮素抗体中的半胱氨酸共价连接。15.根据权利要求11所述的adc，其中所述抗间皮素抗体包含氨基酸序列seq id no：1和seq id no：2。16.根据权利要求15所述的adc，其中所述adc具有在2和6之间的dar，包括端值在内。17.一种治疗具有表达间皮素的肿瘤的癌症患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用包含抗间皮素抗体和拓扑异构酶抑制剂的抗体-药物缀合物(adc)，所述抗间皮素抗体包含如seq id no：7-12中所示的氨基酸。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：间皮瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胃肠癌、子宫内膜癌、胆管癌和胰腺癌。
19.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括以下步骤：通过使来自所述患者的身体样品与包含seq id no：7-12的氨基酸序列的抗体接触来检测所述患者中间皮素表位的存在。20.根据权利要求17所述的方法，其中所述患者相对于健康人群具有高水平的ca125。21.根据权利要求17所述的方法，其中通过施用双特异性抗体来治疗多个患者，其中所述多个患者包括相对于健康人群具有高水平的ca125的至少一个患者和具有正常水平的ca125的至少一个患者。22.一种双特异性抗体(bsp)，所述双特异性抗体包含间皮素结合部分和细胞表面抗原cd3结合部分，所述间皮素结合部分包含氨基酸序列seq id no：7-12。23.根据权利要求22所述的双特异性抗体，其中所述细胞表面抗原cd3结合部分包含cdr氨基酸序列seq id no：13-18。24.根据权利要求22所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含与单链抗体融合的包含seq id no：1的氨基酸序列的抗间皮素抗体的轻链，所述单链抗体识别包含seq id no：6的氨基酸序列的人细胞表面抗原cd3。25.根据权利要求22所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含含有seq id no：1的氨基酸序列的抗间皮素抗体的轻链并且所述轻链通过包含一个或多个氨基酸单元ggggs(seq id no：20)的间隔区单元与所述cd3单链抗体连接。26.一种核酸载体，所述核酸载体编码根据权利要求22所述的双特异性抗体。27.根据权利要求26所述的核酸载体，所述核酸载体包含seq id no：4和seq id no：5的核酸序列。28.一种稳定细胞系，所述稳定细胞系包含编码根据权利要求22所述的双特异性抗体的一种或多种核酸。29.根据权利要求28所述的稳定细胞系，其中所述一种或多种核酸包含seq id no：4和seq id no：5的核酸序列。30.一种治疗患者中表达间皮素的癌症的方法，所述方法包括：向所述患者施用根据权利要求22所述的双特异性抗体，从而治疗所述表达间皮素的癌症。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述表达间皮素的癌症选自由以下项组成的组：间皮瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胃肠癌、子宫内膜癌、胆管癌和胰腺癌。32.根据权利要求30所述的方法，所述方法还包括以下步骤：通过使所述患者的身体样品与包含互补决定区(cdr)的抗体接触来测试患者，从而检测所述患者的所述癌症中的间皮素表位，所述互补决定区包含seq id no：7-12的氨基酸序列。33.根据权利要求30所述的方法，其中通过施用所述双特异性抗体来治疗多个患者，其中所述多个患者包括相对于健康人群具有高水平的ca125的至少一个患者和具有正常水平的ca125的至少一个患者。34.根据权利要求30所述的方法，其中所述患者相对于健康人群具有高水平的ca125。

技术总结
肿瘤利用多种机制来避免宿主的抗肿瘤免疫应答。体液免疫阻抑是所述机制之一。肿瘤产生循环因子，所述循环因子可阻抑抗体或补体介导的免疫应答以增强其自身的存活。间皮素是由与表现出免疫阻抑微环境的肿瘤相关联的几种癌症类型过度表达的细胞表面蛋白。抗间皮素抗体常常经受此类免疫阻抑微环境。然而，替代性格式化的抗间皮素抗体在杀伤表达间皮素的癌症中是有效的，而与肿瘤微环境免疫状态无关。而与肿瘤微环境免疫状态无关。而与肿瘤微环境免疫状态无关。


技术研发人员：L
受保护的技术使用者：纳夫罗根公司
技术研发日：2021.09.28
技术公布日：2023/7/7