三级淋巴结构在制备肾癌分型诊断或预后评估中的应用

1.本发明涉及医学生物检测技术领域，涉及三级淋巴结构的新用途，尤其涉及三级淋巴结构在制备肾癌分型诊断或预后评估中的应用。


背景技术：

2.三级淋巴结构(tertiary lymphoid structures,tlss)是肿瘤微环境(tumor microenvironment,tme)中由趋化因子驱动的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,tils)聚集形成的具有抗肿瘤免疫功能的结构。既往研究表明tlss与多种实体肿瘤患者良好的预后有关，并且能提高免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,icis)对肿瘤患者的疗效。然而tlss在肾细胞癌(renal cell carcinoma,rcc)中的作用仍存在争议，并且分子机制不明。
3.2020年，全球约有1930万新发癌症患者，肾癌是泌尿系统中最常见的临床病理类型，近年来rcc在诊疗手段上有了很大的提升，但rcc的整体切除率较低，且术后复发率和死亡率高，导致rcc患者5年生存率仅为15％左右。因此，如何提升rcc患者生存时间成为了目前最棘手的问题。随着靶向和免疫治疗的开发和精准治疗理念在临床中的应用，不仅增加了rcc的可切除率，而且还显著的延长了晚期rcc患者的中位生存期。但rcc患者对icis和靶向药物的客观反应率较低和耐药率较高，严重阻碍了新辅助治疗的临床应用。
4.由肿瘤细胞、tils、基质细胞等组成的tme异质性较大，是促进肿瘤生长和发生免疫耐受的罪魁祸首，导致了肿瘤细胞出现免疫逃逸现象。因此，tme中的tils被认为是rcc患者免疫治疗的最终靶点。tls主要是由cd3
+ t细胞、cd8
+ t细胞、cd20
+ b细胞、浆细胞、树突状细胞和巨噬细胞等组成(图1)，提升免疫功能进而影响肿瘤患者的预后。tlss按照成熟程度可分为淋巴细胞聚集、无生发中心的圆形淋巴细胞簇(原发性滤泡)和有生发中心的滤泡。生发中心是b细胞扩增、免疫球蛋白类转化、体细胞高突变和亲和力成熟的位点，生发中心的出现可以改善hcc患者的预后。研究表明，tlss与胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌和黑色素瘤等肿瘤患者的良好预后相关，并且有tlss的肿瘤患者对靶向药物和icis的客观反应率显著高于无tlss的肿瘤患者。但在rcc的研究中，tlss与患者预后的关系仍存在争议，其作用机制尚不清楚。
5.tlss是由趋化因子驱动淋巴细胞聚集形成的具有启动免疫应答和发生抗肿瘤作用的新生免疫淋巴结构，常发生在慢性感染、免疫性疾病和肿瘤等疾病。tls的形成主要由肿瘤微环境中的淋巴组织形成体细胞(lto)和淋巴组织诱导细胞(lymphoid tissue inducer cell，lti细胞)如th17细胞、b细胞、m1型巨噬细胞等诱导。lti细胞是一种先天的淋巴样细胞，lto细胞是一种间充质细胞，后分化为滤泡树突状细胞(fdc)和纤维母细胞网状细胞(frc)(图2)。
6.tlss的抗肿瘤机制可能是众多成分的联合作用或者是其中的单个成分的作用，包括t细胞的细胞免疫、b细胞的体液免疫和树突状细胞抗原提呈能力等。tlss的形成离不开趋化因子c-c基序配体(c-cmotif ligand，ccl)2，-3，-4，-5，-8，-18，-19，-21，和c-x-c基序
趋化因子配体(c-x-c motif chemokine ligand，cxcl)9，-10，-11，-13对淋巴细胞的诱导作用。这12个趋化因子在tlss形成过程中是必不可少的，各自发挥着重要的功能：ccl19和ccl21通过ccr7调节t细胞激活与驱动，而cxcl13则通过招募和激活b细胞促进tlss的形成和成熟。tlss的抗肿瘤免疫能力主要与b细胞和t细胞相关，其中t细胞已被证明是实体肿瘤良好的临床预后有关，但是b细胞在tme中的作用仍然不清楚。一方面，b细胞可以产生抗体和充当抗原提呈细胞诱导t细胞发生细胞免疫、促进nk细胞的功能和增强巨噬细胞的吞噬能力等作用于肿瘤细胞。另一方面，b细胞又可以通过产生自身抗体、表达免疫抑制配体或细胞因子促进肿瘤的发展，从而抑制抗肿瘤免疫反应。而tlss在肾癌中的作用机制、对肾癌患者的预后提示意义以及在肾癌免疫治疗方面的作用现在仍是未解之谜。
7.人体的抗肿瘤免疫主要由获得性免疫和固有免疫两大部分组成。在机体获得性免疫应答中，免疫系统可形成一个杀伤肿瘤细胞的癌症-免疫环(cancer immunity cycle,cic)。在此过程中，一旦肿瘤细胞被杀死，相关抗原被释放，循环又将重新开始，进一步加强免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤。如果cic中任何一个环节出现问题，都将导致这个循环的中断，从而削弱机体免疫系统的抗肿瘤免疫应答，使肿瘤发生免疫逃逸。一个理想的抗肿瘤免疫治疗药物最好能够作用到上述所有步骤，打通所有环节，最大限度发挥抗肿瘤作用。现有的研究表明，三级淋巴结构本身会对cic中的抗原释放、吸引t细胞浸润到肿瘤中以及加强t细胞对肿瘤细胞识别等几个步骤有促进作用，但无法完全覆盖。
8.因此，为了充分获取实体肿瘤患者机体获得性免疫的所有环节并激活固有免疫，充分发挥抗肿瘤免疫效应特点，越来越多的检测方法被应用于肿瘤组织和癌旁组织中三级淋巴结构的检测，代表性方法有苏木素-伊红染色(he staining)、免疫荧光染色、免疫组化染色以及携带多个抗体的免疫组化染色。依托多重荧光免疫组化技术平台，研究者可以全景剖析肿瘤免疫微环境中的杀伤性t细胞、耗竭性t细胞、巨噬细胞、b细胞、三级淋巴结构和免疫检查点受体的浸润情况，全面评估患者的预后和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤免疫微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理。然而这些检测方法尚未形成病理识别和临床应用的统一规范，因此有较夯实的理论基础和专利转化至临床应用的实施价值。
9.肾细胞癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤肿瘤之一，约占所有成人男性新发病例5％，占女性新发病例的3％。据统计，2019年全美约有73,820例肾癌新发例和14,770例死亡病例，我国每年新发肾癌患者约6.68万例，居泌尿系统肿瘤发病率的第二位。肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccrcc)是最常见的、恶性程度较高的肾癌病理类型，约占全部肾癌患者的70-85％，约25-30％的ccrcc患者初诊即出现转移，而转移性ccrcc的5年生存率仅为32％。对于临床局限期的肿瘤而言，治疗手段仍以保留肾单位手术或根治性肾切除干预为主，术后进一步的细胞因子或个体化精准辅助治疗可减少肿瘤复发转移率，提高患者远期生存率。目前晚期肾癌的一线治疗药物以靶向血管内皮生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂为主，如培唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、阿西替尼、卡博替尼等。尽管抗血管生成药物在一定程度上可以抑制肿瘤增殖，可以显著延长低危ccrcc患者生存，但药物副反应明显，总体疗效欠佳，治疗的客观反应率仅不到30％，延长的中位总生存时间也不到12个月。此外，即使是最初治疗有效的患者，也会在一段时间后出现疾病进展，此时多数患者将缺乏后续的有效治疗手段。
10.近年来，以pd-1/pd-l1、ctla4抑制剂为代表的新型免疫治疗在肾癌治疗领域迅速崛起，对晚期难治性患者显示出令人鼓舞的疗效。自2015年fda基于checkmate025研究批准了纳武利尤单抗应用于既往接受过抗血管生成药物治疗的晚期肾细胞癌患者，2020年asco gu公布了checkmate025研究的5年随访结果，结果显示纳武利尤单抗二线治疗的5年生存率高达26％，彰显了免疫治疗的生存获益优势。随后，免疫检查点抑制剂逐渐从二线走向了一线，目前pd-1单抗联合ctla-4单抗及pd-1/pd-l1单抗联合抗血管生成药物一线治疗晚期肾癌在fda相继获批，晚期肾癌的治疗引来了新的篇章。
11.肾癌独特的肿瘤微环境是其恶性程度远远高于其他肿瘤的重要原因之一，也是导致肾癌患者对放化疗和免疫治疗不敏感以及预后差的主要原因之一。免疫检查点抑制剂联合tki从诱导抗肿瘤免疫正常化、抑制晚期肾癌发生发展的主要信号通路及肿瘤微环境多种角度发挥作用，其成功有赖于对肿瘤细胞及肿瘤微环境相互作用的深刻理解。随着研究的深入，更多证据表明，不仅免疫治疗的疗效依赖于肿瘤免疫微环境的激活，靶向治疗等传统治疗手段的疗效同样取决于机体抗肿瘤免疫反应的强弱。肿瘤微环境中的细胞和分子处于动态变化的过程，反映了癌症的进化本质，并共同促进肿瘤的免疫逃逸、生长和转移。探索肿瘤微环境驱动的肿瘤发生和发展的潜在机制对于开发癌症治疗的潜在方法、提高各种已有治疗手段有效率、发现新的肾癌治疗精确靶点具有重要意义。因此，调控微环境中的肿瘤外源性调控因子对理解肿瘤细胞恶行生物学行为、肿瘤免疫反应与肿瘤免疫逃逸的博弈过程至关重要，为调节肿瘤免疫提供新的方向。
12.有研究发现，仅20％左右的肾癌患者具有相对较高pd-l1的阳性表达。但有临床数据表明，pd-1/pd-l1抑制剂单药治疗对肾癌患者疗效不佳，可能的主要原因是癌的肿瘤微环境中缺乏t细胞浸润。因此，增加t细胞在肾癌肿瘤微环境中的比例，可以改善icis治疗不佳或耐受的效果，如何增强肾癌icis治疗效果的研究，是肾癌研究的热点之一。
13.从肾癌肿瘤微环境的特点出发，设计新的免疫治疗策略来消除肾癌免疫抑制环境，对于治疗肾癌具有重要意义。通过肿瘤局部和周围全景分析肿瘤免疫微环境，病理学家和临床医生可以通过三级淋巴结构的位置和成熟度异质性建立肾癌患者预后评估系统，全面评测患者的复发风险和接受免疫抑制剂治疗的疗效，挖掘肿瘤免疫微环境与肿瘤发生发展、复发、转移和耐药机制的关系和临床分子机理；此外三级淋巴结构可以激发后向肿瘤组织释放细胞因子，重塑肿瘤免疫微环境、趋化免疫细胞浸润到肿瘤组织，促进“冷肿瘤”向“热肿瘤”转变。可三级淋巴结构以显著改变肿瘤微环境，吸引免疫细胞浸润的特点，可以有效预测肾癌患者接受综合治疗的响应率。目前，尚未有文献报道三级淋巴结构在制备肾癌预后评估系统中的应用。


技术实现要素：

14.本发明基于上述研究进行，目的在于提供三级淋巴结构在制备肾癌分型诊断或预后评估中的应用以及衍生而来的肾癌分型诊断或预后评估系统，也在于提供其在治疗肾癌中的应用。
15.本发明首先通过苏木精-伊红(he)染色证实了三级淋巴结构在在肾癌肿瘤组织、肿瘤基质组织和癌旁正常组织中均存在，并稳定表现出高度浸润的t淋巴细胞以及聚集成团的b细胞，其所特有的生发中心结构也能检测发现。以上结果提示三级淋巴结构在肾癌病
理状态中存在，并且具有改善肿瘤免疫微环境，并提高具有协同抗肿瘤免疫杀伤的的潜能。
16.第二步，由于三级淋巴结构存在成熟度的显著差异，即tls在病理条件下的不同生长阶段。因此利用每张hpf图像评估tls成熟阶段如下：早期tls(early tls,e-tls)，缺乏cd20和cd21信号的密集淋巴细胞聚集物；原发性滤泡样tls(primary follicle-like tls,pfl-tls)，具有cd21信号的密集淋巴细胞聚集，但没有cd20信号；次生滤泡样tls(secondary follicle-like tls,sfl-tls)，具备cd21信号的密集淋巴细胞聚集，存在b细胞(cd20信号)密集聚集的生发中心(gc)。结果显示，肾癌肿瘤组织、肿瘤基质组织和癌旁正常组织中均存在不同成熟度的tls。说明和肝癌、肺癌等其他实体瘤类似，tls广泛存在于肿瘤组织和癌周组织中可以启动浸润性的抗肿瘤免疫反应。
17.第三步，tls的瘤周或瘤内位置与临床结果之间没有明确的关系，为了探究tls位置异质性与肾癌患者预后的关系，我们纳入了两组具有可用临床随访和临床病理数据的真实世界集(训练集，n＝290，来自复旦大学附属肿瘤医院[fuscc]；验证集n＝105，来自外部队列)，共计395例ccrcc患者，纳入生存分析。
[0018]
在来自fuscc队列的290例中国ccrcc患者中，瘤内tls阳性的存在显著预示着ccrcc更好的长期生存(os:p《0.001,hr＝0.456)和抑制性进展(pfs:p＝0.002,hr＝0.387)。相反，瘤周tls阳性与ccrcc长期生存不良(os:p＝0.021,hr＝1.444)和进展性进展(pfs:p＝0.020,hr＝1.486)显著相关。同样，在外部验证集中，瘤内tls的存在与延长os(p＝0.012,hr＝0.263)和抑制pfs(p＝0.042,hr＝0.167)显著相关。然而，105例ccrcc患者瘤周tls阳性也与不良os(p＝0.009,hr＝2.024)和进展性pfs(p＝0.043,hr＝1.993)显著相关。这些研究结果表明，肾癌tls的定位异质性可有效区分肾癌患者风险分层和预后差异。
[0019]
第四步，为了进一步借助tls位置异质性建立肾癌患者精准预后评估系统，我们对来自两个不同队列共计395例肾癌患者进行单因素和多因素cox回归分析。在单因素cox回归分析中，传统的预后预测因素，如病理tnm分期、isup细胞核分级、ajcc分期、瘤内和瘤周存在tls与否均和肾癌患者的总生存期(overall survival,os)和无复发进展生存期(progression-free survival,pfs)显著相关。在多因素cox回归分析中，pt分期、pm分期、isup分级、有无瘤内tls仍与两种pfs相关和os；在fuscc队列中。同样，在纳入105例肾癌患者的外部验证集中，pt期、pm期、isup分级以及瘤内tls的存在也与pfs和os显著相关。
[0020]
接着，我们使用fuscc集作为训练队列，基于多元cox回归分析构建了涉及瘤内tls定位和成熟度异质性的nomogram，以预测肾癌患者术后2年、5年和8年总生存期(overall survival,os)和无复发进展生存期(progression-free survival,pfs)。纳入这四个变量，290例ccrcc患者的瘤内tls相关风险评分与异常侵袭性pfs显著相关。时间依赖性roc曲线的auc值高于0.80(2年auc＝0.82,5年auc＝0.82,8年auc＝0.84)，表明预测pfs的nomogram方法具有较高的敏感性和特异性。此外，纳入瘤内tls、pt分期、pm分期和isup分级后，290例ccrcc患者os预测nomogram风险评分升高与os缩短显著相关。时间依赖性roc曲线的auc值也表明，2年auc为0.78，5年auc为0.82，8年auc为0.83。此外，我们对来自外部验证集的105例ccrcc患者进行了涉及瘤内tls的nomogram检查，发现较高的风险评分显著预示着进展性pfs和较差的os。综上所述，这些结果证明了肿瘤内tls对肾癌患者存在敏感且独立的预后效率，并揭示了纳入肿瘤内tls存在的nomogram图可以显著区分肿瘤长期复发高风险患者和临床预后较差的患者，能够建立起精准的肾癌患者预后评估系统。
[0021]
第五步，tls在抗肿瘤的过程中起到了积极作用，关于tls提高肿瘤免疫的机理和临床应用也有诸多案例。例如，hev招募各种免疫细胞，包括t细胞，b细胞；b细胞也招募各种免疫细胞：t细胞，nk细胞，dc细胞，成熟的dc促进对t细胞和b细胞的抗原递呈，但也有报道：tls在某些环境下可以被肿瘤细胞应用，促进肿瘤细胞的淋巴浸润，导致肿瘤的淋巴转移。为了探究tls改变肿瘤免疫微环境的具体机制，我们对肾癌肿瘤组织进行细胞定量的多重免疫组织化学染色，评估多种肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤组织中的分布以及和三级淋巴结构的关系。我们先后定义了肿瘤和间质浸润的一系列淋巴细胞，并通过算法定量计算其每百细胞的比例，包括treg、耗竭性t细胞、m2巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤细胞，发现随着tls成熟度的增高抗肿瘤免疫激活相关的淋巴细胞聚集增多，且treg细胞被显著抑制，提示响应免疫治疗的肿瘤组织中的tls，呈现出成熟的次级滤泡样tls结构。提示成熟的tls结构可以通过激活效应t细胞同时减少treg细胞募集来改善肿瘤免疫抑制性微环境。
[0022]
上述研究表明，瘤内tls尤其成熟tls可用于一线治疗失败的中晚期或高危肾癌患者以及手术可切除肾癌患者的辅助治疗决策和预后评估。
[0023]
基于上述研究，本发明的第一方面，提供了三级淋巴结构在制备肾癌分型诊断或预后评估试剂或试剂盒中的应用。
[0024]
优选的，所述肾癌分型诊断或预后评估试剂为对肾癌组织样品中三级淋巴结构进行瘤内定位以及成熟度检测的试剂；所述试剂盒包含了对三级淋巴结构进行瘤内定位以及成熟度异质性检测的试剂。
[0025]
进一步优选，对三级淋巴结构进行瘤内定位检测的试剂为he染色试剂，通过he染色，实现对tls在瘤内、瘤周组织内的定位情况检测。对三级淋巴结构进行成熟度异质性检测的试剂为免疫组化检测试剂或多重荧光免疫组化检测试剂。免疫组化检测实现对不同成熟程度tls内特征信号检测，以达到不同成熟程度tls区分；多重荧光免疫组化用于获得多个细胞的组成和实现细胞功能检测。
[0026]
进一步优选，免疫组化检测试剂或多重荧光免疫组化检测试剂中均含有检测三级淋巴结构中次生滤泡特征信号的抗体，为cd20和cd21抗体。
[0027]
本发明的第二方面，提供了一种肾癌分型诊断或预后评估试剂盒，该试剂盒包含了对生物样品中三级淋巴结构进行瘤内定位以及成熟度检测的试剂。优选的，对三级淋巴结构进行定位检测的试剂为he染色试剂，对三级淋巴结构进行成熟度检测的试剂至少包括进行次生滤泡样特征信号检测的cd20和cd21抗体。
[0028]
本发明的第三方面，提供了促进三级淋巴结构形成或促进其中次生滤泡形成的试剂在制备治疗肾癌药物中的应用。
[0029]
本发明的第四方面，提供了一种治疗肾癌的药物组合物，包括活性组分以及药学或医学上可接受的辅料，其中，活性组分包括促进三级淋巴结构形成或促进其中次生滤泡样tls形成的试剂。
[0030]
本发明的第五方面，提供了一种肾癌分型诊断或预后评估系统，其特征在于，包括试剂盒以及安装在终端载体上的分析系统。
[0031]
其中，试剂盒为上述所述的肾癌分型诊断或预后评估试剂盒；分析系统包括图像拍摄组件、阳性信号计数系统、细胞密度计算系统。图像拍摄组件独立或集成于显微镜上，用于对免疫组化图像或免疫荧光图像进行拍摄；阳性信号计数系统对图像中的阳性信号进
行显现和计数；细胞密度计算系统计算切片组织区域面积，并根据截断值进行细胞密度区分。
[0032]
本发明的有益保障及效果如下：
[0033]
本发明利用he染色、ihc染色和多重免疫组织化学染色(mihc)等方法对肾癌组织病理学检测，纳入了来自两个队列共计395例ccrcc患者的样本和临床病理学资料，证实了在肾癌组织和癌周组织中存在稳定且具有成熟度差异的不同tls结构，且tls的定位和成熟异质性能够显著预测肾癌患者总生存期和无疾病进展复期。研究结果显示，肿瘤内tls对肾癌患者存在敏感且独立的预后效率，肿瘤内tls可以显著区分肿瘤长期复发高风险。借助tls位置异质性，可以建立起肾癌患者精准预后评估系统。
[0034]
tls能够在免疫治疗期间，诱导更多的外周b细胞和t细胞进入肿瘤组织，发挥更强的适应性抗肿瘤免疫，可有效预测肾癌患者接受icis治疗获益。提示tls可有效改善肿瘤免疫微环境，而改作用主要通过刺激和招募效应t细胞，尤其是cd8
+
t淋巴细胞，发挥抗肿瘤免疫杀伤效能，有助于提升肾癌患者免疫检查点抑制剂治疗疗效，辅助临床医生建立肾癌患者全程精准预后评估系统。随着tls成熟度的增高抗肿瘤免疫激活相关的淋巴细胞聚集增多，且treg细胞被显著抑制，提示响应免疫治疗的肿瘤组织中的tls，呈现出成熟的次级滤泡样tls结构。提示成熟的tls结构可以通过激活效应t细胞同时减少treg细胞募集来改善肿瘤免疫抑制性微环境。
[0035]
因此，本发明为肾癌的临床治疗和预后评估提供了新的精准病理监测指标。
附图说明
[0036]
图1为三级淋巴结构组成成分示意图。
[0037]
图2为三级淋巴结构形成机制示意图。
[0038]
图3是肾癌组织和癌旁正常组织中he染色特征图：肾癌组织内和癌旁正常肾组织中均存在三级淋巴结构(intra-tls和peri-tls)。
[0039]
图4是肾癌组织和癌旁正常组织中e-tls和pfl-tls结构的ihc染色图。cd3，cd20，cd21等抗体结合肿瘤浸润淋巴细胞用于定义tls成熟度.由于三级淋巴结构存在成熟度的显著差异，即tls在病理条件下的不同生长阶段。在有tls存在的切片上进行t细胞(cd3)、b细胞(cd20)和fdcs(cd21)的免疫组化染色。每张hpf图像评估tls成熟阶段如下：早期tls(early tls,e-tls)，缺乏cd20和cd21信号的密集淋巴细胞聚集物；原发性滤泡样tls(primary follicle-like tls,pfl-tls)，密集淋巴细胞聚集，cd21，但没有cd20信号。
[0040]
图5是肾癌组织和癌旁正常组织中sfl-tls结构的ihc染色图。cd3，cd20，cd21等抗体结合肿瘤浸润淋巴细胞用于定义tls成熟度.由于三级淋巴结构存在成熟度的显著差异，即tls在病理条件下的不同生长阶段。在有tls存在的切片上进行t细胞(cd3)、b细胞(cd20)和fdcs(cd21)的免疫组化染色。次生滤泡样tls(secondary follicle-like tls,sfl-tls)，密集淋巴细胞聚集，cd20和cd21信号，表明存在生发中心(gc)。
[0041]
图6是两个队列中tls位置异质性的预测肾癌患者复发和预后风险的生存分析图。在来自fuscc队列的290例中国ccrcc患者中，瘤内tls阳性的存在显著预示着ccrcc更好的长期生存(os:p《0.001,hr＝0.456)和抑制性进展(pfs:p＝0.002,hr＝0.387)。相反，瘤周tls阳性与ccrcc长期生存不良(os:p＝0.021,hr＝1.444)和进展性进展(pfs:p＝0.020,hr
＝1.486)显著相关。同样，在外部验证集中，瘤内tls的存在与延长os(p＝0.012,hr＝0.263)和抑制pfs(p＝0.042,hr＝0.167)显著相关。然而，105例ccrcc患者瘤外tls阳性也与不良os(p＝0.009,hr＝2.024)和进展性pfs(p＝0.043,hr＝1.993)显著相关。这些研究结果表明，肾癌tls的定位异质性可有效区分肾癌患者风险分层和预后差异。
[0042]
图7是定量多重免疫荧光组化染色结果图。为了更好地表征异质性ccrcc样本中的tls，我们在58例ccrcc组织中使用多光谱荧光免疫组化(mihc)研究了tls的细胞组成，并致力于识别tls成熟的异质性及其对局部tme的影响。我们在肾癌的tme活性中检测到12种参与肿瘤进展过程中识别、响应和消除肿瘤细胞的适应性免疫应答细胞标志物)。在第1组中，检测cd8+t细胞、pd-1+cd8+耗竭性t细胞、cd68+cd163-m1巨噬细胞、cd68+cd163+m2巨噬细胞、ck包围的cd68+cd163+tams、pd-l1+cd68+cd163+m2巨噬细胞和pd-l1表达的cps，并进行进一步分析。在第2组中，在tme中评估cd3+t细胞、cd4+t细胞、cd4+foxp3+treg细胞、cd20+b细胞和cd56bright/dimnk细胞的丰度。综上，tls成熟阶段的细胞组成显示了肿瘤浸润淋巴细胞的明显差异的异质性。
[0043]
图8是基于cox回归分析建立的纳入肿瘤内tls存在的nomogram图。在单因素cox回归分析中，传统的预后预测因素，如病理tnm分期、isup细胞核分级、ajcc分期、瘤内和瘤周存在tls与否均和肾癌患者的总生存期(overall survival,os)和无复发进展生存期(progression-free survival,pfs)显著相关。在多因素cox回归分析中，pt分期、pm分期、isup分级、有无瘤内tls仍与两种pfs相关和os；在fuscc队列中，。同样，在纳入105例肾癌患者的外部验证集中，pt期、pm期、isup分级以及瘤内tls的存在也与pfs和os显著相关。多元cox回归分析结果显示，在fuscc训练集中，基于构建了涉及瘤内tls定位和成熟度异质性的nomogram，以预测肾癌患者术后2年、5年和8年总生存期(overall survival,os)和无复发进展生存期(progression-free survival,pfs)。纳入这四个变量，290例ccrcc患者的瘤内tls内相关风险评分与异常侵袭性pfs显著相关，表明预测pfs的nomogram方法具有较高的敏感性和特异性。此外，纳入瘤内tls、pt分期、pm分期和isup分级后，290例ccrcc患者os预测nomogram风险评分升高与os缩短显著相关。时间依赖性roc曲线的auc值也表明，2年auc为0.78，5年auc为0.82，8年auc为0.83。此外，我们对来自外部验证集的105例ccrcc患者进行了涉及瘤内tls的nomogram，发现较高的风险评分显著预示着进展性pfs和较差的os。综上所述，这些结果证明了肿瘤内tls对肾癌患者存在敏感且独立的预后效率，并揭示了纳入肿瘤内tls存在的nomogram图可以显著区分肿瘤长期复发高风险患者和临床预后较差的患者，能够建立起精准的肾癌患者预后评估系统。
[0044]
图9是肾癌中tls的异质性能有效预测免疫检查点抑制剂在肾癌患者中的治疗效果图。结果表明，随着tls成熟度的增加，肿瘤组织内肿瘤杀伤性细胞cd8+t细胞丰度显著增高，且cd4+foxp3+treg细胞比例显著下调，提示了高度活跃的抗肿瘤免疫微环境状态。此外，为了检测tls对于接收免疫抑制剂疗法患者的影响，我们采集了肾透明细胞癌的晚期免疫治疗的bionikk临床研究患者的信息，验证了肿瘤内部tls染色和免疫治疗疗效的关系。结果显示高表达瘤内tls的患者pfs更长；而这群高表达瘤内tls的患者中针对免疫疗法的客观响应率也更高。
具体实施方式
[0045]
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0046]
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
[0047]
一、肾癌和癌旁组织中三级淋巴结构位置和成熟度异质性鉴定
[0048]
一、实验方法：
[0049]
在肾癌组织和癌旁正常肾组织中证实tls的存在，以及其位置和成熟度异质性，可用cd3，cd20，cd21等抗体结合肿瘤浸润淋巴细胞，因此采用he和ihc对此进行检测。
[0050]
1.1苏木素-伊红染色(he)
[0051]
a.切片：由赛维尔公司对福尔马林固定-石蜡包埋样本行连续切片，切片厚度为4微米。
[0052]
b.石蜡切片脱蜡水化：将石蜡切片依次置于二甲苯ⅰ20分钟、二甲苯ⅱ20分钟、无水乙醇ⅰ5分钟、无水乙醇ⅱ5分钟。
[0053]
c.苏木素染色：切片置入苏木素染液4分钟后使用分化液分化30秒，自来水冲洗5分钟；置入返蓝液30秒，自来水冲洗5分钟。
[0054]
d.伊红染色：先使用85％酒精脱水5分钟，再使用95％酒精脱水5分钟；伊红染液染色5分钟。
[0055]
e.脱水封片：切片依次放入无水乙醇i5分钟、无水乙醇ii10分钟、二甲苯ⅰ5分钟、二甲苯ⅱ5分钟，将切片晾至微干后在组织区域滴加适量中性树胶，盖玻片封盖。自然晾干，等待采集图像。
[0056]
1.2免疫组化(ihc)
[0057]
a.石蜡切片脱蜡水化：将石蜡切片依次置于二甲苯ⅰ15分钟、二甲苯ⅱ15分钟、二甲苯ⅲ15分钟、无水乙醇ⅰ5分钟、无水乙醇ⅱ5分钟、85％酒精5分钟、75酒精5分钟、自来水冲洗。
[0058]
b.抗原修复：将切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(ph6.0)的水槽中，微波炉加热8分钟(100℃)，间隔10分钟后再次加热7分钟(80℃)；冷却至室温。
[0059]
c.封闭：pbs冲洗切片5分钟，重复3次；组化笔沿组织边缘画圈防止试剂流失(注意避免破坏组织)，滴加50μl封闭液，室温放置30分钟。
[0060]
d.加一抗：pbs冲洗切片5分钟，重复3次；加入使用一抗稀释液稀释的cd3(1:200)、cd20(1:200)和cd21(1:200)，将切片放置于湿盒内，4℃冰箱过夜。
[0061]
e.加二抗：将切片温度恢复至室温，pbs冲洗切片5分钟，重复3次。加入pbs稀释的二抗(1:800)，室温放置60分钟。
[0062]
f.dab显色：pbs冲洗切片5分钟，重复3次。在圈内滴加新鲜配制的dab显色液(1:20)，显色时间为5分钟，自来水冲洗切片终止显色。
[0063]
g.复染细胞核：切片置于苏木素染液中1分钟，自来水洗5分钟，分化液分化30秒，自来水冲洗5分钟，返蓝液返蓝30秒，流水冲洗5分钟。
[0064]
h.脱水封片：将石蜡切片依次置于75％酒精5分钟、85％酒精5分钟、无水乙醇10分钟、二甲苯ⅰ15分钟、二甲苯ⅱ15分钟、二甲苯ⅲ15分钟，将切片从二甲苯中拿出后稍晾干，
滴加少量中性树胶，盖玻片封片。放置通风处晾干，等待采集图像。
[0065]
进行结果分析时，每张苏木素-伊红染色切片中至少有一个tlss被确认为阳性。这一过程由3个病理学家执行。根据tlss位置程度将其分为：intra-tls和peri-tls。免疫组化图像是由一台连接在cx31显微镜上的奥林巴斯dp20摄像机拍摄。对于免疫荧光图像，则使用荧光显微镜拍摄。在20x镜下记录整张切片中所有tlss区域。使用imagej软件对tlss内阳性信号进行人工计数，计数过程由如前述的3名病理学家共同完成。nanozoomer扫描仪用于扫描切片，纳米缩放数字病理视图软件用于计算切片组织区域面积。细胞密度记录为个/mm2。根据截断值将细胞密度分为高细胞密度组(用high-cd20与high-cd20表示)与低细胞密度组(用low-cd20与low-cd20表示)。kaplan meier生存分析使用log-rank检验，cox比例风险回归分析用于检验独立预后因素。使用x-title软件计算生存分析中分组截断值。
[0066]
1.3多重荧光免疫组化检测(mihc)
[0067]
目前检测肿瘤免疫微环境中的技术主要有基因测序技术、传统免疫组化技术和流失细胞术。这三种技术无法同时获得肿瘤免疫微环境中的细胞组成、细胞定位和细胞功能的相关信息，基因检测和流式细胞术的检测需要裂解肿瘤组织样本获得相关的基因和细胞后才能进行相应的定量检测，因此无法获得肿瘤免疫微环境中关于细胞定位的相关信息；传统免疫组化虽然可以获得检测指标的细胞定位信息，但是没办法获得多个细胞的组成和实现细胞功能的检测。
[0068]
多重荧光免疫组化技术能够对组织样本中5-9个靶点进行成像和分析。它采用类流式的方法对细胞的表型和活性进行定量评估，同时还能提供组织微环境以及与细胞间的空间位置信息，而目前其它技术无法实现这一点。多重荧光免疫组化技术能更加全面准确的将患者分层至最佳治疗路径，具体检测步骤如下：
[0069]
1)采样：小鼠成瘤后，给药治疗。共设置nc对照组，vg160单药组、vg161单药组。分别于给药后第3天、第7天和第15天处死小鼠并留取肿瘤标本。福尔马林固定、石蜡包埋组织，切成厚度为4μm的石蜡切片并固定在防脱玻璃片上。
[0070]
2)染色：基于tsa染色原理，选用辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗抗体，对荧光染料进行活化，将荧光染料共价结合到抗原上。借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色。具体染色流程如下：
[0071]
(a)样本玻片准备：60-65度烤片2h或过夜；xylene浸片10min，重复3次；梯度乙醇浸片，100％5min；95％5min；70％5min；去离子水浸洗玻片3min；
[0072]
(b)微波修复：抗原修复液经煮沸后将玻片放置进入抗原修复盒，微波炉功率调整至低火继续修复15-20min后，室温自然冷却(15-30min)；去离子水浸洗玻片，3％h2o2水处理样品10-15min，去除内源性过氧化物酶；1
×
tbst洗涤样本玻片3min；
[0073]
(c)封闭：去除玻片上的tbst缓冲液，放置在染色湿盒内，免疫组化笔圈出玻片上的组织样本区域；滴加封闭缓冲液覆盖玻片组织区域，保湿孵育10min；
[0074]
(d)一抗孵育：去除玻片上的封闭缓冲液，滴加稀释的一抗工作液，室温保湿孵育1h，1x tbst浸洗，室温震荡3min，重复3次；
[0075]
(e)hrp二抗孵育：去除玻片上的tbst缓冲液，玻片上滴加二抗，室温保湿孵育10min，1xtbst浸洗，室温震荡3min，重复3次；
[0076]
(f)染色信号显色：去除玻片上的tbst缓冲液，玻片上滴加1
×
tsa显色工作液，保
湿孵育5-10min，1
×
tbst浸片，室温震荡3min，重复3次。至此，完成一个蛋白标志物的染色。
[0077]
(g)复染后续蛋白标志物，重复上述步骤(a-f)。
[0078]
(h)dapi染色及封片：去除玻片上的tbst缓冲液，玻片上滴加dapi工作液，室温保湿孵育3-5min，1
×
tbst浸片，室温震荡5min，去除tbst缓冲液；玻片上滴加荧光抗淬灭封片剂封片，指甲油固定盖玻片。
[0079]
3)成像与分析：使用阔然生物医药(上海)有限公司的kr-ht5多光谱成像系统高速扫描并采集经过上述步骤染色后的石蜡切片上所有荧光信号，采用高精度的光谱重叠拆分技术，扣除组织自发荧光信号并分离混合信号中的各单色荧光信号，建立对应的单色荧光光谱库。以病理医生或专家设定的标准，依次进行组织区域识别及拆分，依据dapi染色识别的细胞核进行细胞的细胞核、细胞质、细胞膜的拆分，依据各蛋白在细胞上的标记进行细胞类型的划分，最后分别统计肿瘤实体和间质区域中任一蛋白的单阳、双阳以及三阳细胞占比。
[0080]
(4)统计学分析和模型建立
[0081]
主要终点为无进展生存期(pfs)，次要终点为总生存期(os)。采用kaplan-meier生存法进行生存分析。通过r软件中“survminer”r包确定临界值，并使用95％置信区间(95％ci)的log-rank检验进行评估。为了寻找独立的预测因素，使用单变量和多变量cox logistic回归模型进行了风险比(hr)估计和95％ci。作为生存的补充，使用“rms”和“survival”r包对来自fuscc和外部验证队列的患者进行cox logistic回归分析，以预测pfs和os。该图基于多变量cox回归分析，将瘤内和瘤外tls的存在与多个传统临床病理预测因子整合，然后将复杂的回归方程按比例转化为同一平面上的可视化图形。用nomogram来显示预测模型中各变量之间的关系，准确评价相应的ccrcc患者2年、5年、8年的复发率或生存率。
[0082]
二、实验结果
[0083]
(1)he染色结果显示，肾癌组织内和癌旁正常肾组织中均存在三级淋巴结构(intra-tls和peri-tls)(图3)。
[0084]
(2)ihc染色结果显示，cd3，cd20，cd21抗体结合肿瘤浸润淋巴细胞用于定义tls成熟度。由于三级淋巴结构存在成熟度的显著差异，即tls在病理条件下的不同生长阶段。因此我们利用每张hpf图像评估tls成熟阶段如下：早期tls(earlytls,e-tls)，缺乏cd20和cd21信号的密集淋巴细胞聚集物；原发性滤泡样tls(primary follicle-like tls,pfl-tls)，密集cd21信号的淋巴细胞聚集，但没有cd20信号；次生滤泡样tls(secondary follicle-like tls,sfl-tls)，密集淋巴细胞聚集，存在cd21信号，且存在密集的cd20信号，表明存在生发中心(gc)。肾癌肿瘤组织、肿瘤基质组织和癌旁正常组织中均存在不同成熟度的tls，说明和肝癌、肺癌等其他实体瘤类似，tls广泛存在于肿瘤组织和癌周组织中可以启动浸润性的抗肿瘤免疫反应(图4、图5)。
[0085]
(3)生存分析结果显示，在来自fuscc队列的290例中国ccrcc患者中，瘤内tls阳性的存在显著预示着ccrcc更好的长期生存(os:p《0.001,hr＝0.456)和抑制性进展(pfs:p＝0.002,hr＝0.387)。相反，瘤周tls阳性与ccrcc长期生存不良(os:p＝0.021,hr＝1.444)和进展性进展(pfs:p＝0.020,hr＝1.486)显著相关。同样，在外部验证集中，瘤内tls的存在与延长os(p＝0.012,hr＝0.263)和抑制pfs(p＝0.042,hr＝0.167)显著相关。然而，105例
9,hr＝6.32,8年auc＝0.83)。
[0091]
综上所述，这些结果证明了肿瘤内tls对肾癌患者存在敏感且独立的预后效率，并揭示了纳入肿瘤内tls存在的nomogram图可以显著区分肿瘤长期复发高风险患者和临床预后较差的患者，能够建立起精准的肾癌患者预后评估系统。
[0092]
(5)图9显示了肾癌中tls的异质性能有效预测免疫检查点抑制剂在肾癌患者中的治疗效果。结果表明，随着tls成熟度的增加，肿瘤组织内肿瘤杀伤性细胞cd8
+ t细胞丰度显著增高，且cd4
+
foxp3
+
treg细胞比例显著下调，提示肿瘤微环境的免疫抑制状态被解除，反而呈现出较为活跃的抗肿瘤免疫微环境状态。此外，为了检测tls对于接收免疫抑制剂疗法患者的影响，我们采集了肾透明细胞癌的晚期免疫治疗的bionikk临床研究患者的信息，验证了肿瘤内部tls染色和免疫治疗疗效的关系。结果显示高表达瘤内tls的患者pfs更长(中位数pfs＝16.3月vs6.4月,p＝0.039)；而这群高表达瘤内tls的患者中针对免疫疗法的客观响应率(objective responses,orr)也更高。
[0093]
综上可知，本发明首次鉴定肾癌中三级淋巴结构异质性，为肾癌的临床疗效检测和复发风险评估提供了新的病理监测指标，可有效辅助临床医生建立肾癌患者全程精准预后评估系统。
[0094]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。

技术特征：
1.三级淋巴结构在制备肾癌分型诊断或预后评估试剂或试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾癌分型诊断或预后评估试剂为对肾癌组织样品中三级淋巴结构进行瘤内定位以及成熟度检测的试剂；所述试剂盒包含了对三级淋巴结构进行瘤内定位以及成熟度异质性检测的试剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，对三级淋巴结构进行瘤内定位检测的试剂为he染色试剂；对三级淋巴结构进行成熟度异质性检测的试剂为免疫组化检测试剂或多重荧光免疫组化检测试剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫组化检测试剂或多重荧光免疫组化检测试剂中均含有检测三级淋巴结构中次生滤泡特征信号的抗体。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测次生滤泡样特征信号的抗体为cd20和cd21抗体。6.一种肾癌分型诊断或预后评估试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含了对生物样品中三级淋巴结构进行瘤内定位以及成熟度检测的试剂。7.根据权利要求6所述的肾癌分型诊断或预后评估试剂盒，其特征在于，对三级淋巴结构进行瘤内定位检测的试剂为he染色试剂，对三级淋巴结构进行成熟度检测的试剂至少包括进行次生滤泡样特征信号检测的cd20和cd21抗体。8.促进三级淋巴结构形成或促进其中次生滤泡形成的试剂在制备治疗肾癌药物中的应用。9.一种治疗肾癌的药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学或医学上可接受的辅料，其中，活性组分包括促进三级淋巴结构形成或促进其中次生滤泡样tls形成的试剂。10.一种肾癌分型诊断或预后评估系统，其特征在于，包括试剂盒以及安装在终端载体上的分析系统，所述试剂盒为权利要求6或7所述的肾癌分型诊断或预后评估试剂盒，所述分析系统包括图像拍摄组件、阳性信号计数系统、细胞密度计算系统，所述图像拍摄组件独立或集成于显微镜上，用于对免疫组化图像或免疫荧光图像进行拍摄；所述阳性信号计数系统对图像中的阳性信号进行显现和计数；所述细胞密度计算系统计算切片组织区域面积，并根据截断值进行细胞密度区分。

技术总结
本发明涉及医学生物检测技术领域，提供了三级淋巴结构在制备肾癌分型诊断或预后评估中的应用，具体是在制备肾癌分型诊断或预后评估试剂盒中的应用以及相应的试剂盒和评估系统；还提供了促进三级淋巴结构形成或促进其中次生滤泡形成的试剂在制备治疗肾癌药物中的应用以及治疗肾癌的药物组合物。本发明研究结果显示，肿瘤内TLS对肾癌患者存在敏感且独立的预后效率，肿瘤内TLS可以显著区分肿瘤长期复发高风险。借助TLS位置异质性，可以建立起肾癌患者精准预后评估系统；成熟的TLS结构可以通过激活效应T细胞同时减少Treg细胞募集来改善肿瘤免疫抑制性微环境。因此，本发明为肾癌的临床治疗和预后评估提供了新的精准病理监测指标。测指标。测指标。


技术研发人员：叶定伟 徐文浩 张海梁
受保护的技术使用者：复旦大学附属肿瘤医院
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/7/12