一种申氏菌及其在降解1,4-二噁烷中的应用

flavus dt8、pseudonocardia sp.n23等。这些菌株多具有适用浓度范围有限、降解效率较低、在实际污染环境定植能力较差的特点。目前国内对1,4-二噁烷降解菌分离的工作较少，本研究致力于拓展1,4-二噁烷降解菌种库，拓宽微生物降解1,4-二噁烷的应用浓度范围，以实现1,4-二噁烷污染的经济、绿色、高效且无二次污染的生物修复。


技术实现要素：

6.1、解决的技术问题
7.本发明针对1，4-二噁烷的绿色降解问题，提供了一株降解能力高效、适用浓度范围宽、在实际污染环境定植能力强的1，4-二噁烷降解菌株，可以应用于1,4-二噁烷污染水体和沉积物的处理。
8.2、技术方案
9.本发明第一方面提供了一种申氏菌dxtk-001，所述申氏菌分类命名为shinella yambaruensis strain，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.24590。保藏日期为2022年3月25日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
10.本发明第一方面提供的一种申氏菌，包含seq id no.1的核苷酸序列。
11.本发明第二方面提供一种菌悬液，所述菌悬液包含申氏菌dxtk-001，所述申氏菌分类命名为shinella yambaruensis strain，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.24590。
12.根据本发明第二方面提供的菌悬液，所述菌悬液通过所述申氏菌在25-30℃,150rpm下扩大培养获得。培养时采用的碳源可以为普通碳源，例如葡萄糖、牛肉浸膏等，优选为1,4-二噁烷。
13.根据本发明第二方面提供的菌悬液，所述菌悬液中所述申氏菌的浓度为od
600
大于等于0.05，更优选为大于0.1。
14.本发明第三方面提供一种组合物，所述组合物包含申氏菌dxtk-001，所述申氏菌分类命名为shinella yambaruensis strain，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.24590。
15.根据本发明第三方面提供的组合物，所述组合物中申氏菌的质量百分含量为0.1～99.9％。
16.本发明第四方面提供一种可供于从受污染环境中分离1,4-二噁烷降解菌的方法，包括：采集受1,4-二噁烷污染的环境样本，将环境样本按5％的接种量接种至100ml含有50mg
·
l-11,4-二噁烷为唯一碳源的无机盐培养基中培养，逐渐提高1,4-二噁烷浓度至1000mg
·
l-1
。收集具有1,4-二噁烷降解能力的富集培养物，稀释涂平板，分离到能以1,4-二噁烷为唯一碳源的可培养单菌。
17.本发明第五方面提供了所述申氏菌dxtk-001、含有申氏菌dxtk-001的菌悬液或含有申氏菌dxtk-001的组合物在降解1,4-二噁烷中的应用。
18.根据本发明第五方面任一方案提供的所述申氏菌dxtk-001、含有申氏菌dxtk-001的菌悬液或含有申氏菌dxtk-001的组合物在降解1,4-二噁烷中的应用，包括以下步骤：首先将所述申氏菌dxtk-001进行培养制备成菌悬液，随后加入至含一定浓度1,4-二噁烷的污
染物中培养并进行降解。
19.根据本发明第五方面任一方案提供的所述申氏菌dxtk-001、含有申氏菌dxtk-001的菌悬液或含有申氏菌dxtk-001的组合物在降解1,4-二噁烷中的应用，所述降解条件包括在30℃，150rpm的摇床下培养。培养时采用的碳源可以为普通碳源，例如葡萄糖、牛肉浸膏等，优选为1,4-二噁烷。
20.根据本发明第五方面任一方案提供的所述申氏菌dxtk-001、含有申氏菌dxtk-001的菌悬液或含有申氏菌dxtk-001的组合物在降解1,4-二噁烷中的应用，首先将所述申氏菌在200mg
·
l-1
的1,4-二噁烷msm培养基中培养至降解终点，收集培养液，以一定比例(体积比)接种至待降解的含1,4-二噁烷介质中。所述接种比例可以为5％～100％，例如可以为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％80％、90％或100％，可根据实际处理需求选择。
21.根据本发明第五方面任一方案提供的所述申氏菌dxtk-001、含有申氏菌dxtk-001的菌悬液或含有申氏菌dxtk-001的组合物在降解1,4-二噁烷中的应用，所述1,4-二噁烷浓度范围为0-1000mg
·
l-1
，不包含0。
22.根据本发明第五方面任一方案提供的所述申氏菌dxtk-001、含有申氏菌dxtk-001的菌悬液或含有申氏菌dxtk-001的组合物在降解1,4-二噁烷中的应用，所述申氏菌应用的ph范围为4-9。
23.根据本发明第五方面任一方案提供的所述申氏菌dxtk-001、含有申氏菌dxtk-001的菌悬液或含有申氏菌dxtk-001的组合物在降解1,4-二噁烷中的应用，所述1,4-二噁烷处于水体或沉积物环境中。
24.3、技术效果
25.(1)本发明提供的菌株，能够在1,4-二噁烷为唯一碳源的环境中生长，并对1,4-二噁烷具有高效降解能力，因而该菌株可以实现1,4-二噁烷污染的经济、绿色、高效且无二次污染的生物修复。
26.(2)本发明还在实际污染中进行了生物强化的应用，为该菌株应用于实际污染环境中1,4-二噁烷的修复提供了借鉴。
27.(3)本发明申氏菌在降解1,4-二噁烷中的应用，首先将所述申氏菌在200mg
·
l-1
的1,4-二噁烷条件下培养至降解终点，收集培养液，以一定比例接种至待降解的含1,4-二噁烷介质中；采用该降解终点的菌悬液对介质中1,4-二噁烷进一步培养时，降解速率更快。
28.(4)本发明采用申氏菌降解1,4-二噁烷，具有操作简便、反应条件能耗低、经济成本低、工艺设备成本低、操作条件易实现的特点。
附图说明
29.图1是本发明申氏菌dxtk-001的16s rrna序列进行blast比对后构建的系统发育树；
30.图2是申氏菌dxtk-001在r2a琼脂培养基表面的生长菌落；
31.图3是申氏菌dxtk-001在营养琼脂固体培养基表面的菌落；
32.图4是申氏菌dxtk-001在1,4-二噁烷无机盐琼脂培养基表面的生长菌落；
33.图5是申氏菌dxtk-001在1,4-二噁烷无机盐液体培养基生长形成的絮状菌体；
34.图6是申氏菌dxtk-001的透射电镜图；
35.图7是申氏菌dxtk-001的扫描电镜图；
36.图8是实施例2中申氏菌dxtk-001在30℃，150rpm下对200mg
·
l-1 1,4-二噁烷的降解效果图和生长曲线(含2次循环)；
37.图9是实施例3中申氏菌dxtk-001在30℃，150rpm下对5-100mg
·
l-1 1,4-二噁烷的降解效果；
38.图10是实施例4中申氏菌dxtk-001在不同ph下的降解曲线。
具体实施方式
39.下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的描述，使本发明的技术内容表述更清晰和便于理解。本发明还可以通过更多不同形式的实施例来得以体现，因而本发明的保护范围并不限于本文提到的实施例。
40.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
41.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
42.本发明提供了一株1,4-二噁烷高效降解菌株，申氏菌dxtk-001，分类命名为shinella yambaruensis strain，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.24590，并从以下几个实例展开进行介绍：
43.实施例1
44.菌株的分离纯化、鉴定及保存
45.样品采集与富集培养：样品采集自南京某长期受日用化学品1,4-二噁烷污染影响的市政污水处理设施的活性污泥。称取活性污泥样本5g加入到100ml含50mg
·
l-1 1,4-二噁烷的msm液体培养基中，每隔一个月按5％体积比转接一次，即转接5ml培养液至新鲜的无菌msm培养基中，添加1,4-二噁烷至新的选择压力浓度，一共转接4次，每次都提高1,4-二噁烷浓度(50mg
·
l-1
，100mg
·
l-1
，250mg
·
l-1
，1000mg
·
l-1
)直至1000mg
·
l-1
，作为最后的富集培养物，并对最终的富集培养物对1,4-二噁烷的降解能力进行了验证，可以完全降解1000mg
·
l-1 1,4-二噁烷。
46.对收集的最终富集培养物进行梯度稀释涂布，涂布于无机盐琼脂固体平板上，平板表面涂上50μl 200mg
·
l-1 1,4-二噁烷溶液，待超净台里进行风干后放置与30℃培养箱进行培养，直至生长成单菌落。
47.挑选可以在1,4-二噁烷为唯一碳源的无机盐固体培养基生长的单菌落至新鲜的含200mg
·
l-1
无机盐液体培养基中培养，并监测1,4-二噁烷的剩余浓度，选择生长速度和降解能力最强的降解单菌进行划线，重复多次直至获得纯化后的单菌。
48.其中，所述的msm液体培养基为(每升无菌去离子水中)：na2hpo4·
12h2o 4.5g，k2hpo
4 1.0g，nh4so
4 1.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，cacl2·
2h2o 0.02g，添加微量元素储备液1ml，维生素储备液1ml。微量元素液(每升无菌去离子水中)：mnso4·
h2o 0.1g，na2moo4·
2h2o 0.02g，h3bo
3 0.014g，feso4·
7h2o 1.0g，znso4·
7h2o 0.1g，cuso4·
5h2o 0.02g，cocl2·
6h2o 0.02g。维生素储备液(每升无菌去离子水中)：叶酸2.0g，盐酸吡哆醇10.0g，核
黄素5.0g，生物素2.0g，硫胺素5.0g，烟酸5.0g，泛酸钙5.0g，维生素b12 0.1g，对氨基苯甲酸5.0g，硫辛酸5.0g。
49.msm固体琼脂培养基是在上述液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂粉。
50.菌株的鉴定：经鉴定，上述方法得到的单菌株为革兰氏阴性，杆状，好氧型细菌，氧化酶阳性。使用16s rdna通用引物(27f5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’及1492r5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)进行扩增并测序(序列seq id no.1)。
51.用conaigexpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分。将拼接好的序列在ncbi数据库(blasa.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对，并利用mega软件构建系统发育树，如图1所示。
52.结合生理生化的菌株特征以及系统发育树分析，此菌株鉴定为shinella yambaruensis，于2022年3月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.24590。
53.菌株形态见图2-7。该菌株生长菌落为，为稻草白色的棒状细菌，显微镜下呈短小杆状，具有单极鞭毛，不形成孢子，在液体培养基中形成絮状体。
54.该菌株的保存方法，该菌株的长期保存方法可以以25％的甘油将生长至对数期的菌液保存至-80℃冰箱，或制备成冻干粉保存，短期保存方法可以以菌液或划线至固体培养基培养出单菌落后保存至4℃冰箱。
55.实施例2
56.该菌株的形貌特征及其在1,4-二噁烷中的生长特性
57.菌株的培养条件结合之前报道的1,4-二噁烷降解菌株表达的常用条件。在30℃，150rpm的含200mg
·
l-1
的1,4-二噁烷的msm培养基中培养，每隔一定时间利用分光光度计，测试od
600
，测量结果如图8，所述菌株对200mg
·
l-1 1,4-二噁烷的降解速率为1.93mg
·
(l
·
h)-1
。以降解终点的菌液收集为菌悬液待用，进行降解实验，可以观察到菌悬液od
600
约为0.4，以降解终点的菌悬液进行实验，对200mg
·
l-1 1,4-二噁烷的降解速度达3.66mg
·
(l
·
h)-1
(循环1)，以循环1降解终点的菌液收集为菌悬液待用，进行降解实验，可以观察到菌悬液od
600
约为0.4，对100mg
·
l-1 1,4-二噁烷的降解速度达3.16mg
·
(l
·
h)-1
(循环2)。
58.实施例3
59.菌株对1,4-二噁烷的降解能力
60.首先将菌株在200mg
·
l-1
的1,4-二噁烷msm培养基中培养至降解终点(同实施例2)，此时收集培养液作为菌悬液待用，以10％(体积)的接种量接种至新鲜的含1,4-二噁烷msm培养基中，菌株od
600
约为0.05，开始降解实验，每隔一定时间利用气相色谱gc-fid测定1,4-二噁烷的剩余浓度，以降解终点时刻来标定平均降解速率。采用该方法对5、10、20、50、100mg
·
l-1
的1,4-二噁烷溶液进行降解实验，结果如图9所示，低浓度的申氏菌dxtk-001对不同浓度的1,4-二噁烷仍表现出较好的降解效果。
61.其中，气相色谱gc-fid的检测条件是agilenatechnologies 8860仪器，配备hp ulara2色谱分析柱，载气是高纯氮气，载气流速2ml/min，柱箱程序升温至40℃，进样口温度120℃，检测器温度300℃。
62.实施例4
63.本实施例研究了shinella yambaruensis dxtk-001不同ph下对1,4-二噁烷的降
解能力，shinella yambaruensis dxtk-001od
600
为0.1，设置的初始ph范围为4.0-10.0，包括：4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0。在30℃，150rpm下培养，初始1,4-二噁烷浓度为200mg
·
l-1
，适用ph范围为4-9。如图10所示，菌株shinella yambaruensis dxtk-001在ph为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的条件下，对1,4-二噁烷的降解速率分别为1.60mg
·
(l
·
h)-1
，1.67mg
·
(l
·
h)-1
，1.04mg
·
(l
·
h)-1
，2.78mg
·
(l
·
h)-1
，2.63mg
·
(l
·
h)-1
，1.33mg
·
(l
·
h)-1
。

技术特征：
1.一种申氏菌，所述申氏菌分类命名为shinella yambaruensis strain，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.24590。2.一种申氏菌，包含seq id no.1的核苷酸序列。3.一种菌悬液，其特征在于，所述菌悬液包含一种申氏菌，所述申氏菌分类命名为shinella yambaruensis strain，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.24590。4.根据权利要求3所述的菌悬液，其特征在于，所述的菌悬液通过所述申氏菌在25-30℃,150rpm下扩大培养获得。5.根据权利要求3或4所述的菌悬液，其特征在于，所述申氏菌培养的碳源含有1,4-二噁烷。6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含一种申氏菌，所述申氏菌分类命名为shinella yambaruensis strain，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.24590。7.权利要求1或2所述的申氏菌、或权利要求3所述的菌悬液、或权利要求6所述的组合物在降解1,4-二噁烷中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，首先将所述申氏菌在200mg
·
l-1
的1,4-二噁烷条件下培养至降解终点，收集培养液，以一定比例接种至待降解的含1,4-二噁烷介质中。9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述申氏菌应用的1,4-二噁烷浓度范围为0-1000mg
·
l-1
，不包含0；和或所述申氏菌应用的ph范围为4-9。10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述1,4-二噁烷处于水体或沉积物环境中。

技术总结
本发明公开了一种申氏菌及其在降解1,4-二噁烷中的应用，该申氏菌(Shinella sp.)的分类名为Shinella yambaruensis strain，该菌株于2022年3月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.24590。该菌株能快速降解1,4-二噁烷(英文名称1,4-Dioxane)，且耐受能力强，适用pH范围宽泛，降解适用浓度广(0-1000mg


技术研发人员：刘云 田坤 张玥
受保护的技术使用者：中国科学院南京土壤研究所
技术研发日：2023.03.29
技术公布日：2023/7/12