大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段LcCep192-52及应用的制作方法

大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52及其应用。


背景技术：

2.抗生素的发现和使用是医学史上最重要的突破之一。然而，抗生素的广泛使用和滥用导致细菌不断获得新的遗传特征和耐药基因。此外，食品和环境中的药物残留对人类公共健康构成了极大的威胁。这些问题严重障碍着水产养殖业的健康发展。在海水养殖场的各种基质中，抗生素抗性基因具有极高的丰度，并构成潜在的生态健康风险(wangjh,luj,wu j,et al.proliferation of antibiotic resistance genes in coastal recirculating mariculture system.environpollut,2019,248:462-70.)。此外，最近世界卫生组织(who)强调，大多数候选抗生素只是对现有分子的修饰，并不针对耐药的革兰氏阴性菌。然而，水产动物传染病主要由多重耐药革兰氏阴性菌引起，鱼类生活的水环境也更有利于细菌和其他微生物的生存，寻找抗生素的替代品迫在眉睫。
3.抗菌肽作为一种天然的宿主防御肽，广泛分布于动物、植物和微生物中。它通常被描述为一类小分子肽(长度在100个氨基酸以内)，对细菌、寄生虫、病毒、真菌、肿瘤细胞和炎症具有显著活性。大多数抗菌肽是阳离子肽，含有2至13个正电荷，具有高比例的疏水残基(通常为50％)。这些特征允抗菌肽通过静电吸引和疏水残基插入到带负电的细菌表面，通过诱导环形孔(即虫洞)、桶壁或地毯模型现象，导致细菌膜稳定性紊乱，最终导致细菌细胞死亡。此外，一些抗菌肽还可以穿透细菌细胞膜到达细胞内，阻断细胞的关键过程，例如干扰蛋白质/核酸合成、蛋白质/酶活性、细胞分裂和蛋白质正确折叠等(zhangr,xul,dongc.antimicrobialpeptides:an overview oftheirstructure,functionandmechanism of action.proteinpeptlet,2022,29:641-50.)。除了直接杀死微生物外，抗菌肽还可以通过多种方式影响宿主对感染的反应，包括调节趋化因子和细胞因子的产生、血管生成、内毒素中和作用和伤口愈合等(luoy,songy.mechanism ofantimicrobial peptides:antimicrobial,anti-inflammatoryandantibiofilmactivities.intjmol sci,2021,22:11401)。此外，amps可以通过刺激粘液合成、促进紧密连接蛋白的产生和内皮修复来影响肠屏障的完整性huz,zhangc,sifuentes-dominguezl,zarekcm,etal.smallproline-richprotein2aisagutbactericidalprotein deployedduringhelminthinfection.science,2021,374:e6723.)。更有趣的是，越来越多的证据表明，抗菌肽之间或抗菌肽与抗生素之间存在协同作用，这些组合可以显著降低细菌耐药性(ormondes dfj,resende fa,cardoso ka,et al.synergistic activity and immunomodulatory potential of levofloxacin and synoeca-mp peptide against multi-resistant strains of klebsiella pneumoniae.microb pathog,2022,163:105403.)。由于抗菌肽具有罕见的耐药性、广谱抗菌活性、快速杀伤作用和高协同作用等优点，目前，抗菌肽被认为是替代抗生素的最佳替代候选药物。
4.在动物细胞中，中心体是最主要的微管组织中心，对细胞运动和极性、纤毛生长以及细胞分裂都具有重要作用。中心体蛋白192参与中心体复制过程中的原中心粒组装，与cep152、cep63和cep57等蛋白共同形成负责招募下游蛋白的环形支架。中心体的组装是一个伴随细胞周期进行的过程,一些结构蛋白的突变或表达量的异常往往会导致细胞有丝分裂的异常,并且常常与肿瘤的发生、纤毛异常以及病毒感染等疾病相关，但未见中心体蛋白片段有关抗菌抗虫活性的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52，lccep192-52氨基酸序列为seq id no.2所示，对应的核苷酸序列为seq id no.1所示。
6.本发明的另一个目的在于提供大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52的应用，包括但不限于制备抑菌剂，或杀虫剂，或者饲料添加剂。
7.为了完成以上目的，本发明采用如下技术方案：申请人通过将大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52的编码基因与pet-32a质粒重组，构建得到原核表达载体pet-32a-lccep192-52，将pet-32a-lccep192-52热激转化至大肠杆菌dh5α高效感受态细胞中扩增，提取质粒再转入大肠杆菌bl21细胞中，获得pet-32a-lccep192-52融合表达菌株，诱导表达，超声波破碎，纯化，获得大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52。lccep192-52对应的核苷酸序列为seq id no.1，对应氨基酸的序列为seq id no.2所示。lccep192-52可用任何制备蛋白的方式得到，包括但不限于原核、真核表达，合成等。
8.大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52的核苷酸序列seq id no.1和氨基酸的序列seq id no.2均属于本发明的保护范围。
9.一种大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52的应用，包括利用本发明提供的抗菌肽制备成抑菌药物或杀虫药物，亦或者饲料添加剂。
10.以上所述的应用中，所述的抗菌/虫剂可抑制或杀灭的细菌和寄生虫包括但不限于：副溶血弧菌、创伤弧菌和盾纤毛虫。
11.与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明涉及到的大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52能有效抑制革兰氏阴性细菌生长，特别是对化学药物难以控制的副溶血弧菌、创伤弧菌具有较强的杀菌作用。同时，lccep192-52对盾纤毛虫在短时间内就有较强的杀虫作用。溶血实验证明，lccep192-52对鱼类、虾类、哺乳类动物血细胞无毒性。lccep192-52在后期研究中有望用于生物防治水生动物、哺乳动物病害，或可作为一种药物，亦或作为饲料添加剂进行开发和利用。
附图说明
12.图1为lccep192-52重组蛋白表达纯化结果。
13.图2为lccep192-52和对照对副溶血弧菌和创伤弧菌的抑/杀菌作用。a，副溶血弧菌；b，创伤弧菌。
14.图3为lccep192-52和对照对副溶血弧菌和创伤弧菌抑/杀菌作用后的扫描电镜观
vulnificus)为指示菌，将指示菌以1％-2％v/v接种量接种到lb液体培养基中，于28℃(副溶血弧菌和创伤弧菌)，120-150r/min，震荡培养8-10h，将细菌od
600
调整至1.0。
30.双层板制备：先倒入固体lb培养基作为下层板，静置3-5min；再取300μl指示菌与3ml半固体培养基温和混匀，迅速倒在上述下层板上，轻轻摇晃均匀，待半固体培养基凝固后，将培养皿划分为若干个区域，每个区域放置一个无菌的牛津杯。
31.抑菌活性测定：将纯化的lccep192-52蛋白浓度调整到500μg/ml，取50μl缓慢加入牛津杯，于28℃培养18h，测量抑菌圈大小并拍照。用pet-32a空载体蛋白作为对照。
32.图2为lccep192-52和空载体蛋白对照对副溶血弧菌和创伤弧菌的抑/杀菌作用，抑菌圈大小见表1。
33.表1lccep192-52的抑/杀菌活性实施例3：lccep192-52杀菌机制选择副溶血弧菌和创伤弧菌为指示菌，用工作培养基将细菌调整到1
×
108cuf/ml(od600＝1.0)。将lccep192-52以最终浓度为500μg/ml加入到细菌溶液中，混合物在28℃下在24孔板中培养2h。用2.5％戊二醛在4℃下固定样品3h之后，在系列分级乙醇中脱水。最后，样品用100％乙醇充分脱水后在超净工作台中风干，在扫描电镜下观察菌体。以pet-32a空载蛋白作为对照。
34.图3为lccep192-52和空载体蛋白对照对副溶血弧菌和创伤弧菌抑/杀菌作用后的扫描电镜观察结果。图3显示空载体对照组副溶血弧菌(图3a)和创伤弧菌(图3c)呈短杆状，表面布满菌毛和鞭毛。lccep192-52与指示菌共培养2h后，副溶血弧菌(图3b)菌毛消失，细胞穿孔；创伤弧菌(图3d)菌毛消失，细胞皱缩。
35.实施例4：lccep192-52杀虫效果：将收集到的大黄鱼盾纤毛虫在16℃培养箱中培养，每天更换1-2次灭菌过滤的新鲜海水。第3～4天，当盾纤毛虫适应培养环境，能够稳定扩增即可用于实验。将约300只盾纤毛虫幼虫加入到含有500μg/ml lccep192-52蛋白溶液的48孔板中，总体积为1.5ml。4℃下用5.0％戊二醛固定200μl混合物固定3h。用灭菌后的海水替代lccep192-52蛋白溶液作为对照。光学显微镜下观察虫体。
36.图4为lccep192-52和对照对盾纤毛虫的杀灭作用。图4a显示对照组的盾纤毛虫，虫体饱满，自由游动，纤毛整齐完整，内部储存颗粒呈现浅黑色。lccep192-52与盾纤毛虫作用15min后，虫体游动缓慢，纤毛变得杂乱(图4b)；30min后，虫体细胞开始出现破裂，内部储存颗粒累积，颜色加深，纤毛呈混乱状态(图4c)；1h后，虫体破裂严重，纤毛大部分消失(图4d)；2h后，盾纤毛虫整个虫体崩解(图4e)。
37.实施例5：lccep192-52的热稳定性测定：调整抗菌肽浓度：取lccep192-52蛋白和pet-32a空载体蛋白分别置于2ml离心管内，将所用抗菌肽和空载体用pbs缓冲液调整浓度为500μg/ml，备用。
38.不同温度处理抗菌肽：将lccep192-52蛋白和pet-32a空载体蛋白分别在25℃、50℃、75℃、100℃条件下热处理30min，结束后置于室温，备用。
39.抑菌实验：采用琼脂糖扩散法测定抗菌活性，方法同实施例2。
40.图5为lccep192-52的热稳定性实验结果图。当温度达到100℃时，lccep192-52对副溶血弧菌和创伤弧菌抑菌活性基本不变。
41.实施例6：lccep192-52的细胞毒性：分别取新鲜的大黄鱼鱼血、虾血、兔血，4℃，5000rpm，离心10min。弃上清，用0.25m的pbs缓冲液(ph＝7.2)重悬沉淀3次，4℃3000rpm离心5min，得到血细胞。用相同浓度的tbs缓冲液将血细胞稀释至1％，并将lccep192-52蛋白调至不同浓度。取50μl血细胞悬浮液与50μl不同浓度的lccep192-52蛋白于96孔细胞培养板中37℃共孵育1h，阳性对照为灭菌后的超纯水(完全溶血)，阴性对照为上述tbs缓冲液(不溶血)。孵育1h后，4000rpm，离心10min，除去细胞碎片。取100μl上清于新的96孔细胞培养板中，测定在540nm处的吸光值。计算公式：溶血率(％)＝(实验组a540
–
阴性对照a540)/(阳性对照a540
–
阴性对照a540)
×
100％实验表明(表2)，lccep192-52蛋白对鱼、虾和哺乳动物血细胞几乎无毒性，可作为抗生素替代药物(表2中的lccep192-52蛋白浓度，指的是与血细胞悬浮液混合前的蛋白浓度)。
42.表2lccep192-52蛋白的溶血性分析以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52，其特征在于：氨基酸序列如seq id no.2所示。2.权利要求1所述大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52的编码基因，其特征在于：核苷酸序列如seq id no.1所示。3.权利要求1所述的大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52或者权利要求2所述的编码基因在制备抑菌剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抑菌剂用于抑制副溶血弧菌、创伤弧菌。5.权利要求1所述的大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52或者权利要求2所述的编码基因在制备杀虫剂中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述杀虫剂用于杀伤盾纤毛虫。7.权利要求1所述的大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段lccep192-52或者权利要求2所述的编码基因在制备饲料添加剂中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体公开了大黄鱼中心体蛋白192抗菌抗虫片段LcCep192-52及其应用。所述抗菌抗虫片段LcCep192-52氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因如SEQ ID NO.1所示。申请人通过构建原核表达载体，诱导表达，超声波破碎，纯化，获得大黄鱼中心体蛋白192片段LcCep192-52。LcCep192-52对副溶血弧菌、创伤弧菌和盾纤毛虫具有杀灭作用；且在温度25-100℃，LcCep192-52抗菌活性基本不受影响。此外，LcCep192-52对鱼、虾、哺乳动物兔子的血细胞无溶血性毒性。LcCep192-52可应用于水产和哺乳动物细菌性和寄生虫疾病的生物防治，或可作为抗菌剂、杀虫剂及饲料添加剂。杀虫剂及饲料添加剂。


技术研发人员：张东玲 陈美玲 王志勇
受保护的技术使用者：权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图3页
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/7/18