高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒及其制备和使用方法与流程

1.本发明属于稻米品质检测技术领域，具体涉及一种高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒及其制备和使用方法。


背景技术：

2.叶酸，一种水溶性b族维生素，分子式为c
19h19
n7o6，因绿叶中含量十分丰富而得名，也称为喋酰谷氨酸、vb9、维生素m，是四氢叶酸及其系列衍生物的总称。
3.叶酸在生物体内的代谢过程较为复杂，它是介导一碳代谢的重要辅助因子，也是维持植物细胞正常功能的基础物质之一。叶酸作为机体细胞生长和繁殖必不可少的维生素之一，在人类营养与健康方面起着重要的关键作用，严重缺乏叶酸时会导致神经管缺陷类疾病等，而人类自身不能合成叶酸，只能通过外源食物摄取。
4.作物营养强化在改善叶酸等微量营养缺乏方面发挥着重要作用，可以有效解决“隐性饥饿”问题。稻米是主要消费的粮食作物之一，其叶酸含量约8μg/100g，无法满足稻米消费人群每天400μg的推荐叶酸摄入量，这可以通过高叶酸稻米产品的研发来实现。因此，高效、精准的稻米叶酸检测成为高叶酸水稻种质研究的关键。
5.近年来，叶酸含量测定已出现多种不同的检测技术。目前，常用的叶酸测定方法有：微生物法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、荧光检测法和酶联免疫法等，相对应的检测试剂盒也陆续被研发，但专门针对稻米叶酸含量测定的高效、精准检测试剂盒在市面上还未见销售。最早发展的微生物法是检测总叶酸的经典技术，尤其适用于植物材料的叶酸含量测定，是国际测定食物成分中叶酸含量的常用方法；但因在测试试剂准备环节繁琐且无法准确掌握所需用量而造成多次制备 或浪费和保存难，因需要环境条件严、样品量大、耗材规格大、试剂用量大且无法统一连续操作而造成实验误差、耗时费力、准确性低，进而无法直接应用于检测数量多、操作时间短且结果准确性要求高的稻米叶酸含量检测。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒及其制备和使用方法，对高叶酸水稻种质创制和高叶酸稻米产品开发提供技术支撑，具有广泛的应用前景和市场价值。
7.为实现上述目的，本发明采取如下技术方案是：一种高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒的制备方法，1）测定指示菌制备，利用鼠李糖乳杆菌冻干粉经复活、单克隆、扩繁、适应性培养、清洗和富集过程制备，体积为120μl/管，-80℃保存；按照以下步骤在无菌条件下进行：
①
鼠李糖乳杆菌活化培养：蘸取少量鼠李糖乳杆菌冻干粉，原始菌株，atcc7469，溶于1.0ml乳酸杆菌肉汤液体培养基，37℃静置、暗培养直至产生浑浊；蘸取少量菌液至乳酸杆菌肉汤固体培养基进行划线接种，37℃静置、暗培养直至出现单克隆菌斑；挑取单克隆菌斑至乳酸杆菌肉汤液体培养基中，37℃静置、暗培养至菌液od600为0.6～0.8之间；
②
鼠李糖乳杆菌的叶酸环境适应性培养：将步骤
①
中活化培养的菌液按照菌液:培养基=1:100体积比加入到体积比为1:1的叶酸测定培养基与0.15ng/ml叶酸标准液的混合溶液中，37℃静置、暗培养至菌液od600为0.6～0.8之间；
③
制备指示菌：将步骤
②
中菌液富集，5000rpm离心10min，弃上清；加入等量的0.9% nacl溶液，振荡悬浮，5000rpm离心10min，弃上清，重复2次；少量多次地加入0.9% nacl溶液，充分混匀，并调整菌液od600为0.8；准确吸取60μl分装至0.2ml无菌ep管中，按照体积比1:1加入灭菌50%甘油，充分混匀，得测定指示菌，-80℃保存备用；2）叶酸标准液制备，利用叶酸标准品经溶解、稀释和标定步骤配制的，浓度为2.0ng/ml、体积为81.1μl/管，4℃保存，按照以下步骤在弱光、无菌环境下进行：
①
配制叶酸标准贮备液：称取叶酸标准品，使用0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液溶解并定容，配制20.0μg/ml叶酸标准贮备液，避光保存于4℃待用；
②
配制叶酸标准中间液：量取叶酸标准贮备液，使用0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液稀释并定容，制得4.0μg/ml叶酸标准中间液，使用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液于无菌管中，避光保存于4℃待用；
③
标定叶酸标准中间液：以0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液为空白调零，使用紫外分光光度计，于光径1cm比色杯、在256nm条件下，测定3～5次吸光度值，求平均值并按照公式：浓度μg/ml=平均吸光度值/摩尔消光系数24500
×
叶酸相对分子量441.40
×
换算系数1000计算，得出叶酸标准中间液的浓度；
④
叶酸标准液制备：准确量取叶酸标准中间液，使用0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液稀释并定容至浓度为2.0ng/ml，精准分装81.1μl至1.5ml避光无菌ep管中、密封，得叶酸标准液，4℃保存备用；3）叶酸测定培养基是利用叶酸测定培养基基质，按照质量比188:1加入了抗坏血酸，质量为1.701g/瓶，4℃保存。
8.一种根据所述的制备方法制备的高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒，所述试剂盒包括：1
×
测定指示菌、1
×
叶酸标准液、1
×
叶酸测定培养基、3
×
无菌水、1
×
无菌微孔板、1
×
封板膜、1
×
无菌滤膜、1
×
无菌注射器、1
×
铝箔遮光袋。
9.一种所述的高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒的使用方法，按照以下步骤在无菌弱光条件下进行：（1）测定前0.5h，从-80℃和4℃取出测定指示菌和叶酸标准液、叶酸测定培养基、无菌水，置于常温；（2）打开叶酸测定培养基，将18ml无菌水加入瓶中，盖好瓶盖，涡旋充分溶解，沸水浴5min，间隔混匀2～3次，冰上迅速冷却，使用0.22μm无菌滤膜过滤，用无菌离心管收集滤液，待用；（3）取出叶酸标准液，短暂离心，将1.0ml无菌水加入管内，盖紧管盖，充分混匀，待用；（4）取出微孔板，避免污染微孔板和触摸微孔板管底部，将叶酸标准液准确吸取0μl、15μl、30μl、60μl、90μl和150μl分别加入到微孔板的孔底，使用无菌水补至150μl，重复三次，共18孔，即标准样品0、1、2、3、4、5，对应浓度分别为0、0.015、0.030、0.060、0.090和0.15ng/ml；
（5）根据稻米叶酸含量范围和提取情况，确定样品叶酸提取物浓度需稀释倍数，将样品叶酸提取物使用无菌水稀释合适倍数，稀释后浓度介于0.015-0.15ng/ml之间至无菌管中，充分混匀，得测试样品，将150μl测试样品依次加入到微孔板的孔底；（6）将测定指示菌混合均匀并短暂离心，加入到新制的叶酸测定培养基，涡旋充分混匀，依次吸取150μl悬空加到含有标准样品或“测试样品的微孔板孔中；（7）将“贴板膜”紧密粘于微孔板表面，禁止触摸膜内侧表面和微孔板底部，密封，水平混匀数次，保持水平状态轻轻装入铝箔遮光袋，37℃静置、暗培养46-48h；（8）培养结束后，置于4℃冰箱冷却15min取出，水平检查微孔板各孔并保持密封，水平用力混匀数十次；（9）从微孔板一侧轻轻揭去贴板膜，避免培养物溅出，操作时保持水平、禁止触摸和污染微孔板底部，放入酶标仪在540-630nm下测定培养物od值；（10）使用数据处理软件，利用标准样品的浓度x与测定的od值y拟合4参数标准曲线，根据测试样品的od值y在标准曲线中求得对应的浓度x，依据样品叶酸提取物稀释倍数与其提取情况以及样品重量信息计算出样品中总叶酸含量。
10.所述的步骤（3）～（6）使用高精准移液器和低吸附枪头。
11.所述的步骤（6）中，测定指示菌与新制叶酸测定培养基的体积比为1:150。
12.所述的步骤（7）在37℃静置、暗培养46h后，进行培养物测定。
13.所述的步骤（9）培养物测定波长选择600nm。
14.所述的步骤（9）设置酶标仪，选择酶标板型号costar 96 flat transparent，设置测定温度25℃，振动环绕120s、线性120s、幅度1mm，测定波长600nm，孔读方式大小3*3、满圆、border为2000μm；孔读次数25、间隔时间20ms。
15.所述的稻米包括糙米、精米。
16.本发明试剂盒的检测原理是：根据叶酸是鼠李糖乳杆菌（atcc7469）生长发育所必须的营养元素，在一定条件下培养基中的总叶酸量与指示菌的生长繁殖呈正比关系，利用指示菌的生长情况（即培养物的浑浊度，od值）对样品的总叶酸含量进行定量分析；具体是指示菌在含有样品和叶酸测定培养基的微孔板中生长，经酶标仪测定od值后，利用“标准样品”测得的od值（y）与对应的浓度（x）来拟合4参数标准曲线（当标准曲线r2≥0.995时符合要求），再根据标准曲线由“测试样品”的od值（y）求得对应的浓度（x），然后依据“样品叶酸提取物”稀释倍数与其提取情况以及样品重量信息计算出样品中总叶酸含量。
17.本发明的微生物法稻米总叶酸含量检测试剂盒，具有以下优点：（1）操作简便、易掌握；（2）检测样本数量多、耗材少；（3）样品用量少、效率高；（4）实验精密度高、重复性好，结果准确可靠。
附图说明
18.图1是本发明中叶酸标准中间液波长扫描图。
19.图2是本发明中叶酸标准样品培养物生长曲线图。
20.图3是本发明中叶酸测试样品培养物波长扫描图。
21.图4是本发明中总叶酸检测试剂盒测定标准曲线图。
具体实施方式
22.为了更加清楚明白地描述，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明，以下结合附图与实施例，对本发明进行进一步详细说明。本领域技术人员可以借鉴该内容，适当改进工艺参数。本发明的方法及应用是通过较佳实施例进行描述的，相关人员不在脱离本发明内容、精神和实质下，对本发明的方法和应用所做的修改或变更，均属于本发明的范围。若未特别指明，本发明提供的叶酸检测试剂盒中所用材料或试剂均可由市场购得，仪器也是由专业技术设备公司提供。
23.实施例一“叶酸标准液”的配制按照以下步骤，在弱光、无菌条件下进行配制：（1）量取100ml无水乙醇，与ddh2o混合并定容至500ml，混匀即得“20%乙醇溶液”，称取0.1042g naoh（含量≥96.0%），用“20%乙醇溶液”溶解并定容至250ml，使用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液于无菌瓶内，即得“0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液”，保存于4℃待用。
24.（2）准确称取“叶酸标准品”1mg，使用“0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液”溶解并定容至50ml，得浓度约20.0μg/ml的“叶酸标准贮备液”，避光保存于4℃待用。
25.（3）量取2.0ml“叶酸标准贮备液”，使用“0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液”定容至10ml，得浓度约4.0μg/ml“叶酸标准中间液”，使用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液于无菌管中，保存于4℃待用。“叶酸标准中间液”波长扫描图如图1所示。
26.（4）以“0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液”为空白调零，用紫外分光光度计，于光径1cm比色杯、在256nm条件下，测定“叶酸标准中间液”的3次吸光度值分别为0.2315、0.2325和0.2311，按照公式（浓度μg/ml=平均吸光度值/摩尔消光系数（24500）
×
叶酸相对分子量（441.40）
×
换算系数（1000））计算得出“叶酸标准中间液”的准确浓度为4.174μg/ml。
27.（5）准确吸取“叶酸标准贮备液”9.58μl，使用“0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液”定容至20ml，得浓度为2.0ng/ml的“叶酸标准液”，准确分装81.1μl至1.5ml避光密封无菌ep管中，保存于4℃待用。
28.实施例二“测定指示菌”的制备按照以下步骤，在无菌条件下进行制备：（1）称取3.55g“乳酸杆菌肉汤培养”基质，溶于100ml ddh2o，121℃灭菌15min，取出混匀，冰上冷却，得“乳酸杆菌肉汤液体培养基”，保存于4℃待用。
29.（2）称取3.55g“乳酸杆菌肉汤培养”基质和1.0g“琼脂粉”，溶于100ml ddh2o，121℃灭菌15min，取出混匀、冷却至适宜温度，分装20ml至无菌培养皿中，冷凝并晾干，封口倒置，得“乳酸杆菌肉汤固体培养基”，保存于4℃待用。
30.（3）称取0.9g nacl，使用ddh2o溶解并定容至100ml，使用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液于无菌管内，得“0.9%nacl溶液”，保存于4℃待用。
31.（4）称取0.94g叶酸测定培养基质（可以选用商品化的，主要成分为酸水解酪蛋白10.0g/l、葡萄糖40.0g/l、乙酸钠40.0g/l、磷酸二氢钾1.0g/l、磷酸氢二钾1.0g/l、dl-色氨酸0.2g/l、l-胱氨酸盐酸盐0.5g/l、l-天冬氨酸0.6g/l、腺嘌呤0.01g/l、鸟嘌呤盐酸盐 0.01g/l、尿嘧啶0.01g/l、黄嘌呤0.02g/l、吐温80 0.1g/l、还原型谷胱甘肽0.005g/l、无水
硫酸镁0.2g/l、氯化钠0.02g/l、硫酸亚铁0.02g/l、硫酸锰0.015g/l、核黄素 0.001g/l、对氨基苯甲酸0.002g/l、盐酸吡哆醇0.004g/l、盐酸硫胺素0.0004g/l、泛酸钙0.0008g/l、烟酸0.0008g/l、生物素0.00002g/l。）和0.005g抗坏血酸，充分溶解于10ml ddh2o中，沸水浴5min（间隔混匀2次），迅速冰上冷却后，使用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液于无菌管，得“叶酸测定培养基”。
32.（5）取出“叶酸标准液”，短暂离心，加入1.0ml无菌水，盖紧管盖，充分混匀，得“0.15ng/ml叶酸标准液”。
33.（6）从-20℃取出“鼠李糖乳杆菌”冻干粉（atcc7469），用无菌枪头蘸取少量冻干粉至含有1.0ml“乳酸杆菌肉汤液体培养基”的ep管中，37℃静置、暗培养（约24h）直至产生浑浊；使用无菌枪头蘸取少量的上述菌液，在“乳酸杆菌肉汤固体培养基”进行划线接种，37℃静置、暗培养（约20h）直至出现单克隆菌斑；使用无菌枪头挑取单克隆菌斑，于1.0ml“乳酸杆菌肉汤液体培养基”的ep管中，37℃静置、暗培养（约18h）至菌液od600为0.813。
34.（7）吸取步骤（6）菌液40μl，加入到2ml“叶酸测定培养基”与2ml的“0.15ng/ml叶酸标准液”混合溶液中，混匀，37℃静置、暗培养（约14h）至菌液od600为0.757。
35.（8）将步骤（7）菌液以5000rpm离心10min、弃上清，加入10ml的“0.9% nacl溶液”并振荡悬浮清洗菌体，再次以5000rpm离心10min、弃上清，重复上述清洗步骤2次。清洗完毕，向菌体中少量多次地加入“0.9% nacl溶液”混匀，并调整菌液od600为0.782。
36.（9）分装上述菌液60μl至0.2ml无菌ep管，加入60μl灭菌50%甘油，充分混匀，得“测定指示菌”，保存于-80℃备用。
37.实施例三“总叶酸含量检测试剂盒”的技术指标——建立标准曲线按照以下步骤，开展3次独立的标准曲线重复性实验，在弱光、无菌条件下进行：（1）测定前约0.5h，从-80℃和4℃取出“测定指示菌”和“叶酸标准液”、“叶酸测定培养基”、“无菌水”及试剂盒中的其他物品，置于常温；（2）打开“叶酸测定培养基”，将18ml无菌水加入瓶中，盖好瓶盖，涡旋充分溶解，沸水浴5min（间隔混匀2次），冰上迅速冷却，使用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液于无菌离心管中，待用；（3）取出“叶酸标准液”，短暂离心，将1.0ml无菌水加入管内，盖紧管盖，充分混匀，待用；（4）小心取出微孔板，避免触碰其底部，将“叶酸标准液”准确吸取0μl、15μl、30μl、60μl、90μl和150μl分别加入到微孔板的孔底，使用无菌ddh2o补至150μl，重复三次，即为“标准样品”，其浓度分别为0 ng/ml（标0）、0.015 ng/ml（标1）、0.030 ng/ml（标2）、0.060 ng/ml（标3）、0.090 ng/ml（标4）和0.150ng/ml（标5）；（5）将“测定指示菌”混合均匀并短暂离心后，加入到新制的“叶酸测定培养基”，涡旋充分混匀，依次吸取150μl悬空加到含有“标准样品”的板孔中；（6）将“贴板膜”紧密粘于微孔板表面，密封，水平混匀数次，轻轻装入铝箔遮光袋，37℃静置、暗培养46h；（7）培养结束后，置于4℃冷却15min，取出检查微孔板各孔并保持密封，水平用力混匀数十次；（8）从微孔板一侧轻轻揭去“贴板膜”，避免培养物溅出，操作时禁止触摸和污染微
孔板底部，放入酶标仪；（9）将酶标仪设定如下，选择酶标板型号（costar 96 flat transparent），设置测定温度（25℃）、振动（环绕120s、线性120s、幅度1mm）、测定波长（600nm）、孔读方式（大小3*3、满圆、border为2000μm）、孔读次数（25）、间隔时间（20ms），在600nm下测定各培养物的od值；本发明中叶酸标准样品培养物生长曲线如图2所示。
38.（10）使用数据处理软件，利用“标准样品”的浓度（x）与测得的od值（y），拟合4参数标准曲线；（11）结果如表1：各浓度“标准样品”的od600在各独立实验内重复间的标准偏差（sd）均小于0.5，相对标准偏差（rsd）均小于15%，建立标准曲线的r2都大于0.995；各浓度“标准样品”的od600在各独立实验间的标准偏差（sd）也均小于0.5，相对标准偏差（rsd）也均小于15%，建立标准曲线的r2也大于0.995；说明建立的标准曲线稳定性较好，符合测定要求。
39.表1.标准曲线建立重复性实验结果
40.本发明的标准曲线覆盖范围是0.015～0.150ng/ml；为了得到样品中的叶酸含量，先以叶酸标准样品的浓度为x轴、以叶酸标准样品培养物在600nm下的od值为y轴、以四参数拟合方程方式进行建立标准曲线（r2≥0.995），再根据“测试样品”的od值（y）求得对应的浓度（x），最后依据“样品叶酸提取物”提取情况和“测试样品”稀释倍数以及样品重量等信息计算出样品总叶酸含量。典型的标准曲线如附图4所示（稻米总叶酸检测试剂盒标准曲线图）。
41.实施例四“总叶酸含量检测试剂盒”的技术指标——测定准确度按照以下步骤，开展6个已知浓度标准样品测定（空白加标回收）实验，在弱光、无菌条件下进行：（1）将2.0ng/ml的“叶酸标准液”，使用“无菌水”稀释配制成浓度为0.020ng/ml、0.039 ng/ml、0.058 ng/ml、0.077 ng/ml、0.095 ng/ml、0.113 ng/ml的“测试样品”；（2）步骤同实施例三的（1）～（4）；（3）将150μl“测试样品”依次加入到微孔板的孔底，重复6次；（4）将“测定指示菌”混合均匀并短暂离心后，加入到新制的“叶酸测定培养基”，涡旋充分混匀，依次吸取150μl悬空加到含有“标准样品”和“测试样品”的板孔中；
（5）步骤同实施例三的（6）～（9）；（6）使用数据处理软件，利用“标准样品”的浓度（x）与测得的od值（y），拟合4参数标准曲线，当标准曲线r2≥0.995时符合要求，根据“测试样品”的od值（y）在标准曲线中求得对应的浓度（x）；（7）结果如表2：建立标准曲线的r2=0.999符合要求，各已知浓度标准样品的测定浓度在重复间的标准偏差（sd）均小于0.01，相对标准偏差（rsd）均小于10%；已知浓度标准样品的测定浓度介于其已知理论浓度的0.957～1.169倍之间，即空白加标回收率为95.7-116.9%，说明测定准确度较高。
[0042][0043][0044]
实施例五“总叶酸含量检测试剂盒”的技术指标——测定精密性按照以下步骤，开展10个未知浓度稻米样品测定实验，在弱光、无菌条件下进行：（1）将10个未知浓度的稻米样品叶酸提取物，使用无菌水稀释800倍（稀释后浓度介于0.015-0.15ng/ml之间），得“测试样品”；（2）步骤同实施例四的（2）～（6）；（3）结果如表3：建立标准曲线的r2=0.999符合要求，各未知浓度稻米样品叶酸提取物的测定浓度在重复间的标准偏差（sd）均小于0.01，相对标准偏差（rsd）均小于10%；说明测定精密性较好。
[0045]
表3.未知浓度样品测定精密性实验结果
[0046]
实施例六“总叶酸含量检测试剂盒”的技术指标——验证样品加标回收率按照以下步骤，开展4个未知浓度稻米样品加入已知浓度标准样品的测定实验，在弱光、无菌条件下进行：（1）使用无菌水将“叶酸标准中间液”稀释配制成浓度为4.0ng/ml的“已知浓度标准样品”；（2）使用无菌水将4个未知浓度的稻米样品叶酸提取物稀释800倍（稀释后浓度介
于0.015-0.15ng/ml之间），得“测试样品”；（3）步骤同实施例三的（1）～（4）；（4）将150μl“测试样品”依次加入到微孔板的孔底、重复2次，将148.6μl“测试样品1、2、3”和1.4μl“已知浓度标准样品”依次加入到微孔板的孔底、重复2次；将149μl“测试样品3、4、5”和1.0μl“已知浓度标准样品”依次加入到微孔板的孔底、重复2次；（5）步骤同实施例四的（4）～（6）；（6）结果如表4：建立标准曲线的r2=0.999符合要求，以未知浓度样品测定出的实测浓度为“测试样品浓度”，以已知浓度标准样品和未知浓度样品混合液的实测浓度为“加标样品浓度”，利用公式加标回收率=（加标样品浓度*测试总体积-测试样品浓度*测试样品体积）/理论加标量
×
100%计算各样品加标回收率；各样品加标回收率介于71.583-93.774%之间，符合多数标准认同的回收率应该控制在70-130%之间，表明测定方法较为可靠。
[0047]
表4.未知浓度样品验证加标回收率实验结果
[0048]
通过实施例三、四、五、六，说明本发明“稻米总叶酸含量检测试剂盒”的标准曲线符合测定要求，其测定结果的准确度较高、重复性较好和可靠性较高，达到应用标准。
[0049]
实施例七“稻米总叶酸含量检测试剂盒”的应用在使用稻米总叶酸含量检测试剂盒时，实施例一、实施例二已按标准步骤制备完毕。试剂盒使用人可按照以下步骤，在弱光、无菌条件下直接对水稻样品进行稻米总叶酸含量测定：（1）测定前约0.5h，从-80℃和4℃取出“测定指示菌”和“叶酸标准液”、“叶酸测定培养基”、“无菌水”及试剂盒中的其他物品，置于常温；（2）打开“叶酸测定培养基”，将18ml无菌水加入瓶中，盖好瓶盖，涡旋充分溶解，沸水浴5min（间隔混匀2次），冰上迅速冷却，使用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液于新的无菌离心管中，待用；（3）根据稻米（糙米、精米）中叶酸含量范围和提取情况，将“样品叶酸提取物1、2”使用无菌水，分别稀释400倍和800倍至新的无菌ep管中，充分混匀，得“测试样品”，待用；（4）取出“叶酸标准液”，短暂离心，准确加入1.0ml无菌水至管内，盖紧管盖，充分混匀，待用；（5）小心取出微孔板，禁止触摸和污染微孔板，将“叶酸标准液”准确吸取0μl、15μl、30μl、60μl、90μl和150μl分别加入到微孔板的孔底，使用无菌ddh2o补至150μl，重复三次，即为“标准样品0、1、2、3、4、5”，其对应浓度分别为0、0.015、0.030、0.060、0.090和0.15ng/ml；（6）将150μl“测试样品”依次加入到微孔板的孔底，重复3次；（7）将“测定指示菌”混合均匀并短暂离心后，加入到新制的“叶酸测定培养基”，涡
旋充分混匀，依次吸取150μl悬空加入到含有“标准样品”和“测试样品”的微孔板孔中；（8）将“贴板膜”紧密粘于微孔板表面，禁止触摸膜内侧表面和微孔板底部，密封，水平混匀数次，保持水平状态轻轻装入铝箔遮光袋，37℃静置、暗培养46h；（9）培养结束后，置于4℃冰箱冷却15min取出，水平检查微孔板各孔并保持密封，水平用力混匀数十次；（10）从微孔板一侧轻轻揭去“贴板膜”，避免培养物溅出，操作时保持水平并禁止触摸和污染微孔板底部，放入酶标仪；（11）将酶标仪设定如下，选择酶标板型号（costar 96 flat transparent），设置测定温度（25℃）、振动（环绕120s、线性120s、幅度1mm）、测定波长（600nm）、孔读方式（大小3*3、满圆、border为2000μm）、孔读次数（25）、间隔时间（20ms），在600nm下测定各培养物的od值；本发明中叶酸测试样品培养物波长扫描图如图3所示。
[0050]
（12）使用origin数据处理软件，利用“标准样品”的浓度（x）与测得的od值（y）拟合4参数标准曲线（标准曲线r2=0.9998时符合要求），根据“测试样品”的od值（y）在标准曲线中求得对应的浓度（x），依据“样品叶酸提取物”稀释倍数与其提取情况以及样品重量信息计算出样品中总叶酸含量；（13）结果如表5：稻米样品1的总叶酸含量平均值为22.868μg/100g、标准偏差（sd）为0.130、相对标准偏差（rsd）为0.568%，稻米样品2的总叶酸含量平均值为49.773μg/100g、标准偏差（sd）为1.317、相对标准偏差（rsd）为2.646%。
[0051]
表5.稻米样品总叶酸含量测定实验结果
[0052]
上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施方案仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

技术特征：
1.一种高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括1）测定指示菌制备，利用鼠李糖乳杆菌冻干粉经复活、单克隆、扩繁、适应性培养、清洗和富集过程制备，体积为120μl/管，-80℃保存；按照以下步骤在无菌条件下进行：
①
鼠李糖乳杆菌活化培养：蘸取少量鼠李糖乳杆菌冻干粉，原始菌株，atcc7469，溶于1.0ml乳酸杆菌肉汤液体培养基，37℃静置、暗培养直至产生浑浊；蘸取少量菌液至乳酸杆菌肉汤固体培养基进行划线接种，37℃静置、暗培养直至出现单克隆菌斑；挑取单克隆菌斑至乳酸杆菌肉汤液体培养基中，37℃静置、暗培养至菌液od600为0.6～0.8之间；
②
鼠李糖乳杆菌的叶酸环境适应性培养：将步骤
①
中活化培养的菌液按照菌液:培养基=1:100体积比加入到体积比为1:1的叶酸测定培养基与0.15ng/ml叶酸标准液的混合溶液中，37℃静置、暗培养至菌液od600为0.6～0.8之间；
③
制备指示菌：将步骤
②
中菌液富集，5000rpm离心10min，弃上清；加入等量的0.9% nacl溶液，振荡悬浮，5000rpm离心10min，弃上清，重复2次；少量多次地加入0.9% nacl溶液，充分混匀，并调整菌液od600为0.8；准确吸取60μl分装至0.2ml无菌ep管中，按照体积比1:1加入灭菌50%甘油，充分混匀，得测定指示菌，-80℃保存备用；2）叶酸标准液制备，利用叶酸标准品经溶解、稀释和标定步骤配制的，浓度为2.0ng/ml、体积为81.1μl/管，4℃保存，按照以下步骤在弱光、无菌环境下进行：
①
配制叶酸标准贮备液：称取叶酸标准品，使用0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液溶解并定容，配制20.0μg/ml叶酸标准贮备液，避光保存于4℃待用；
②
配制叶酸标准中间液：量取叶酸标准贮备液，使用0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液稀释并定容，制得4.0μg/ml叶酸标准中间液，使用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液于无菌管中，避光保存于4℃待用；
③
标定叶酸标准中间液：以0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液为空白调零，使用紫外分光光度计，于光径1cm比色杯、在256nm条件下，测定3～5次吸光度值，求平均值并按照公式：浓度μg/ml=平均吸光度值/摩尔消光系数24500
×
叶酸相对分子量441.40
×
换算系数1000计算，得出叶酸标准中间液的浓度；
④
叶酸标准液制备：准确量取叶酸标准中间液，使用0.01mol/l氢氧化钠20%乙醇溶液稀释并定容至浓度为2.0ng/ml，精准分装81.1μl至1.5ml避光无菌ep管中、密封，得叶酸标准液，4℃保存备用；3）叶酸测定培养基制备，利用叶酸测定培养基基质，按照质量比188:1加入了抗坏血酸，质量为1.701g/瓶，4℃保存。2.一种根据权利要求1所述的制备方法制备的高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1
×
测定指示菌、1
×
叶酸标准液、1
×
叶酸测定培养基、3
×
无菌水、1
×
无菌微孔板、1
×
封板膜、1
×
无菌滤膜、1
×
无菌注射器、1
×
铝箔遮光袋。3.一种根据权利要求2所述的高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于，按照以下步骤在无菌弱光条件下进行：（1）测定前0.5h，从-80℃和4℃取出测定指示菌和叶酸标准液、叶酸测定培养基、无菌水，置于常温；（2）打开叶酸测定培养基，将18ml无菌水加入瓶中，盖好瓶盖，涡旋充分溶解，沸水浴5min，间隔混匀2～3次，冰上迅速冷却，使用0.22μm无菌滤膜过滤，用无菌离心管收集滤液，
待用；（3）取出叶酸标准液，短暂离心，将1.0ml无菌水加入管内，盖紧管盖，充分混匀，待用；（4）取出微孔板，避免污染微孔板和触摸微孔板管底部，将叶酸标准液准确吸取0μl、15μl、30μl、60μl、90μl和150μl分别加入到微孔板的孔底，使用无菌水补至150μl，重复三次，共18孔，即标准样品0、1、2、3、4、5，对应浓度分别为0、0.015、0.030、0.060、0.090和0.15ng/ml；（5）根据稻米叶酸含量范围和提取情况，确定样品叶酸提取物浓度需稀释倍数，将样品叶酸提取物使用无菌水稀释合适倍数，稀释后浓度介于0.015-0.15ng/ml之间至无菌管中，充分混匀，得测试样品，将150μl测试样品依次加入到微孔板的孔底；（6）将测定指示菌混合均匀并短暂离心，加入到新制的叶酸测定培养基，涡旋充分混匀，依次吸取150μl悬空加到含有标准样品或“测试样品的微孔板孔中；（7）将“贴板膜”紧密粘于微孔板表面，禁止触摸膜内侧表面和微孔板底部，密封，水平混匀数次，保持水平状态轻轻装入铝箔遮光袋，37℃静置、暗培养46-48h；（8）培养结束后，置于4℃冰箱冷却15min取出，水平检查微孔板各孔并保持密封，水平用力混匀数十次；（9）从微孔板一侧轻轻揭去贴板膜，避免培养物溅出，操作时保持水平、禁止触摸和污染微孔板底部，放入酶标仪在540-630nm下测定培养物od值；（10）使用数据处理软件，利用标准样品的浓度x与测定的od值y拟合4参数标准曲线，根据测试样品的od值y在标准曲线中求得对应的浓度x，依据样品叶酸提取物稀释倍数与其提取情况以及样品重量信息计算出样品中总叶酸含量。4.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述的步骤（3）～（6）使用高精准移液器和低吸附枪头。5.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述的步骤（6）中，测定指示菌与新制叶酸测定培养基的体积比为1:150。6.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述的步骤（7）在37℃静置、暗培养46h后，进行培养物测定。7.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述的步骤（9）培养物测定波长选择600nm。8. 根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述的步骤（9）设置酶标仪，选择酶标板型号costar 96 flat transparent，设置测定温度25℃，振动环绕120s、线性120s、幅度1mm，测定波长600nm，孔读方式大小3*3、满圆、border为2000μm；孔读次数25、间隔时间20ms。9.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述的稻米包括糙米、精米。

技术总结
本发明公开了一种高效、精准稻米总叶酸检测试剂盒及其制备和使用方法。包括1）测定指示菌制备，2）叶酸标准液制备，3）叶酸测定培养基制备。所述试剂盒包括：1


技术研发人员：胡培松 胡时开 唐绍清 来长凯 王玲 焦桂爱 谢黎虹 圣忠华 魏祥进 邵高能 赵凤利
受保护的技术使用者：中国水稻研究所
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/19