五味子丙素在降低补骨脂素肝毒性中的应用

1.本发明涉及中药技术领域，特别是涉及五味子丙素在降低补骨脂素肝毒性中的应用。


背景技术：

2.在2000多年，五味子最早记录在《神农本草经》。五味子果醋可降低高脂饮食大鼠的血脂水平，五味坚果作为营养食品补充剂，可降低患者的高血压及缓解心理压力。在中国和韩国用五味子果实制成茶和草药方，可增强人体机能，缓解疲劳，被广泛用于促进日常生活用品健康的添加剂。五味子无明显的毒性和副作用，可用于治疗多种疾病安全有效的辅助疗法。作为典型的药食两用草本植物，五味子药用可用于治疗非酒精性脂肪肝、乙型肝炎等疾病，其机制与氧化应激、脂肪变性有关。五味子中木质素类成分与其保健治疗密切相关，其中，五味子丙素是五味子的二苯并环辛二烯衍生物，它是一种有效的nrf2激活剂，在针对氧化应激及炎症反应诱导肝毒性中起重要作用。
3.补骨脂有补肾壮阳、补脾健胃之功能，临床上可用于治疗骨质疏松症、骨软化症、哮喘和银屑病等，但随着临床应用的增多，不良反应逐渐显现，其导致的肝损伤具有潜伏期长的特点，且主要以肝细胞损伤为主。补骨脂素可通过影响肝再生、胆汁酸平衡、氧化应激和线粒体功能障碍等途径引起肝毒性。补骨脂诱导的肝毒性也表现在机体胆汁淤积、氧化应激反应和肝再生受到影响等方面，提示补骨脂素是补骨脂产生肝毒性的物质基础。利用现代中医药学的研究方法，开发传统中药中的有效成分，提高传统中药的利用率，对中医药的发展具有重要的意义。传统补益药五味子可与补骨脂辛-酸配伍达到减轻其肝毒性的作用，但尚不明确在五味子中究竟是哪些活性成分在发挥作用。因此，本发明尝试从五味子中寻找可减轻补骨脂素肝毒性，且不良反应相对较轻的活性成分并探讨其减毒机制，为研究中药用药方案和风险防范策略提供参考。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供五味子丙素在降低补骨脂素肝毒性中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明明确了五味子中能降低补骨脂素肝毒性的最佳活性成分，并提出了一个基于毒性直接靶标的单体化学成分，以降低药物不良反应的新策略。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供五味子丙素在制备降低补骨脂素肝毒性的药物中的应用。
7.本发明还提供一种降低补骨脂素肝毒性的药物，所述药物的活性成分仅包括五味子丙素。
8.本发明还提供五味子丙素在制备含补骨脂素的药物中的应用。
9.本发明还提供一种降低含补骨脂素药物的肝毒性的方法，通过在所述药物中添加五味子丙素来降低肝毒性。
10.进一步地，在所述药物中，所述五味子丙素与所述补骨脂素的摩尔比为1：250。
11.本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括补骨脂素和降低补骨脂素肝毒性的物质，降低补骨脂素肝毒性的物质的活性成分仅包括五味子丙素。
12.进一步地，所述五味子丙素与所述补骨脂素的摩尔比为1：250。
13.本发明还提供上述的药物组合物在制备含补骨脂素的药物中的应用。
14.本发明公开了以下技术效果：
15.本发明首先通过tcmsp网站及文献调研筛选“五味子”活性成分，网络药理学分析其减毒机制，随后，利用分子对接和spr技术确定与重组人酪氨酸蛋白激酶(abl1)对接能量值及结合力排名靠前的成分，明确能降低补骨脂素肝毒性的最佳活性成分。将spr、分子对接技术整合提出了一个基于毒性直接靶标的单体化学成分，以降低药物不良反应的新策略。最后，在细胞模型中，利用mtt实验验证五味子丙素降低补骨脂素肝毒性。本发明从相同的毒性靶标与毒性机制角度出发，全面揭示了中药毒副作用的科学内涵及建立了科学安全风险对策，提出了基于毒性直接靶标的中药联用减毒策略和方法推动中医药毒理学发展，保障“毒”临床安全用药，为后续研究中药用药方案和风险防范策略提供参考。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为利用韦恩图在线绘制平台获得244个共同靶点的示意图；
18.图2为五味子活性成分与肝毒性的ppi网络图；
19.图3为核心靶点的筛选过程示意图；
20.图4为go富集分析结果；
21.图5为kegg富集分析结果；
22.图6为利用cytoscape 3.7.2软件建立的五味子的“疾病-成分-靶点-通路”网络图；
23.图7为韦恩图富集补骨脂素与18个五味子成分得到29个共同靶点；
24.图8为韦恩图富集补骨脂素与18个五味子成分得到的共同通路；
25.图9为利用cytoscape3.7.2软件构建补骨脂素与五味子成分的“疾病-成分-共同靶点-共同通路”网络图；
26.图10为sin b(五味子乙素)与直接靶蛋白abl1的三维分子对接模型；
27.图11为sin c(五味子丙素)与直接靶蛋白abl1的三维分子对接模型；
28.图12为sin c与abl1直接靶点结合动力学；
29.图13为sin b与abl1直接靶点结合动力学；
30.图14为sin c和补骨脂素联用对直接靶标abl1的潜在减毒机制；
31.图15为不同浓度sin c联合补骨脂素对l02细胞的抑制作用和对l02细胞存活的影响；其中，a为1-4μm五味子丙素联合补骨脂素对l02细胞的作用，b为单独1-4μm五味子丙素对l02细胞的作用，c为5-25μm五味子丙素联合补骨脂素对l02细胞的作用，d为单独5-25μm五味子丙素对l02细胞的作用；
32.图16为补骨脂素和sin c治疗后alt肝酶活性检测结果；
33.图17为补骨脂素和sin c治疗后ast肝酶活性检测结果。
具体实施方式
34.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
35.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
36.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
37.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
38.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
39.术语说明：
40.本发明所指的补骨脂素，英文名称为psoralen，分子式c
11
h6o3，分子量186.16，cas号66-97-7，结构式如下：
[0041][0042]
本发明所指的五味子乙素，英文名称为schisandrin b，简写sin b，分子式c
23h28
o6，分子量400.47，cas号61281-37-6，结构式如下：
[0043][0044]
本发明所指的五味子丙素，英文名称为schisandrin c，简写sin c，分子式c
22h24
o6，分子量384.42，cas号61301-33-5，结构式如下：
3.7.2中利用“cytonca”插件将每个核心靶点的度中心性“(degree centrality，dc)”、“介度中心性(betweenness centrality，bc)”、“接近中心性(closenesscentrality，cc)”、“特征向量中心性(eigenvector centrality，ec)”、“网络中心性(network centrality，nc)”、“局部边连通性(localaverage connectivity，lac)”进一步筛出核心靶点，将核心靶点名称输入到string数据库，通过绘制蛋白互作网络分析五味子保护肝损伤的潜在靶点。随后，将核心靶点导入metascape(https://metascape.org/)数据库进行gene otology(go)分析与the kyoto encyclopedia ofgenes and genomes(kegg)通路分析。以筛选五味子成分、预测的共同靶点和作用通路3个方面为节点(node)，用network analyzer构建并分析五味子保肝成分的“疾病-成分-靶点-通路”网络药理图。
[0056]
1.5分子对接
[0057]
首先从pubchem数据库中下载五味子成分3d结构的sdf格式文件，经open babel 3.1.1软件转化为mol.2格式文件。然后从pdb蛋白数据库(https://www.pdbus.org/)中下载分辨率高且含有配体的蛋白三维晶体结构abl1(pdb id:2hyy)的蛋白3d结构pdb格式文件。需对蛋白和配体文件进行前处理，使用pymol 2.4.0软件对蛋白进行去水、去除原配体处理，在autodock tools 1.5.6软件中给蛋白受体加氢，后将蛋白选为受体并输出为pdbqt文件；再打开小分子配体的mol.2格式文件，选为配体后指定其root和可旋转键，最后也输出为pdbqt文件。将受体、配体的pdbqt文件一并导入autodock tools 1.5.6软件中，设置对接参数，进行半柔性对接，通过构象结合能和相互作用力分析，选出并保存最优构象，最后利用discovery studio 2016软件分析小分子与配体间的作用力。
[0058]
1.6表面等离子共振法(spr)实验分析
[0059]
将abl1溶于稀释buffer中，配成浓度500μg/ml的溶液。将1mg五味子丙素溶于0.5372mldmso中，浓度为10mm。将配置的五味子丙素用2％的dmso稀释成5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm、0.312μm、0.156μm和0.078μm。纯化的abl1共价固定在cm5传感器芯片上，然后以30ml/min流速注入五味子丙素溶液，将7个浓度点拟合成曲线。根据蛋白与小分子与蛋白快结合快解离的特性，选择亲和力测定中的稳态分析。描述配体和分析物分子之间的结合强度，亲和力用解离平衡常数kd表示。生物学意义为，当模型为1:1时，浓度单位为m，数值越小结合越强。
[0060]
1.7细胞培养及药物处理
[0061]
l02细胞购自武汉普赛诺公司(武汉，中国)，培养在含10wt％fbs的rpmi 1640培养液中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。补骨脂素、五味子乙素、五味子丙素溶于二甲基亚砜中配制成浓度为10mm的母液，分装后于-20℃冰箱中存储，使用时，用rpmi 1640培养基稀释至相应浓度。对数生长期的l02细胞经0.25wt％胰酶消化、rpmi1640培养液冲悬和细胞计数后接种于96孔板(细胞数约5
×
104个)，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h。细胞分组为正常组、溶剂对照组、给药组。24小时后，将板中的培养液去掉，正常组更换为正常培养液继续培养细胞，然后将溶剂对照组更换为含3
‰
dmso的培养基，而给药组，五味子丙素分别与等比浓度为5、10、15、20、25μm的500μm补骨脂素溶液联用，摸索药物联用的最佳浓度；根据前期摸索的药物浓度，再按照等差浓度为1、2、3、4的500μm补骨脂素溶液确定五味子丙素的最佳浓度。各组继续培养24h。实验重复三次。
[0062]
实验中各组细胞的细胞活力采用mtt(solarbio，beijing，china)进行测定。弃去
培养基，每孔加10μl浓度为5mg/ml的mtt溶液(终浓度为0.5mg/ml，避光)，90μl rpmi 1640培养基，继续在37℃培养4h。4h后，去掉培养基，每孔加入150μl的dmso来溶解所有的甲瓒晶体，在室温下保存30min。在酶联免疫检测仪(bio-rad，美国)上波长为490nm处测出各孔的吸光度值。以存活率率为纵坐标，浓度为横坐标，绘制l02细胞活力柱状图。
[0063]
1.8生化指标检测
[0064]
样本的制备：本实验对细胞中的含药上清进行提取，将细胞用胰酶消化后，计数并均匀种于6孔板中(细胞数约1
×
105个)，每孔2ml，放入37℃，5％co2培养箱培养24小时；于第二天相同时间给药；上清4℃1000rpm 5min离心，并-20℃分装保存。上清用alt、ast检测试剂盒进行生化检测分析。
[0065]
alt和ast试剂盒：按照说明书进行操作，轻轻水平摇动96孔板混匀，室温放置15分钟，波长为510nm，酶标仪测定各孔的od值，按照说明书进行计算其相应的肝酶活性。
[0066]
1.9数据分析
[0067]
统计分析采用spss17.0和graph pad prism 8软件。用t检验或者单因素方差分析检验确定空白组和对照组之间的统计学差异。数据表示为平均值
±
标准偏差sd。误差线表示标准差。p《0.05被认为在统计学上有显著性差异。
*
和
#
p《0.05，
**
和
##
p《0.01，
***
和
###
p《0.001相对于单独对照组。
[0068]
2.实验结果
[0069]
2.1五味子成分筛选结果
[0070]
首先，通过tcmsp数据库共筛选6个五味子活性成分(表1所示)，文献筛查出12个活性成分(表2所示)，一共筛出18个主要活性成分。
[0071]
表1tcmsp网站上的五味子有效成分
[0072][0073][0074]
表2文献研究中五味子主要保肝成分
[0075]
[0076]
[0077][0078]
2.2五味子活性成分与肝毒性相关靶基因的获取及ppi分析
[0079]
通过tcmsp数据库共筛选6个五味子活性成分，文献筛查出12个活性成分，一共筛出18个主要活性成分。将18个活性成分的2d结构以sdf的格式上传到pharmmapper和stp数据库，pharmmapper数据库按照z-score》1、stp数据库按照probability》0.1的标准对18个五味子成分靶点进行筛选得到528个成分靶点。本发明利用ctd、genecards、drμgbank、omim数据库，各数据库按照大于2倍中位数筛选疾病靶点。随后按靶点信息相关性得分进行筛选并删除重复项后，输入到uniprot数据库查询其官方命名，共获得2319个肝毒性靶点。利用韦恩图在线绘制平台将二者取交集后获得244个共同靶点，其对五味子与补骨脂素联用减毒作用具有重要意义(图1)。将244个共同靶点录入string数据库，将活性成分和肝毒性共有靶蛋白进行互作分析，构建关系网络，如图2所示，节点数244，边数为2941，平均节点度(average node degree)是24.1。通过string数据库蛋白互作，删除游离节点，将剩余的241个靶点导入cytoscape插件cytonca做进一步筛选。筛选标准选择bc、cc、dc、ec、lac、nc值大于所有中位数值的靶点作为核心靶点。第1次筛选得出的118个主要靶点，随后本发明对主要靶点进一步缩小范围，进行了第2次和第3次筛选，筛选过程见图3，最终获得核心靶点26个，其核心靶点的边数越多表明交互作用越强，成为潜在治疗靶点。网络药理学筛选得到26个潜在靶点，包括直接靶标abl1并文献总结了35个五味子靶点，合并后得到61个保肝靶点(表3)。将61个共同靶点导入到string数据库，删除游离节点，共获得56个靶点。
[0080]
表3成分与abl1靶点间的分子对接情况
[0081][0082]
2.3go和kegg通路富集分析
[0083]
本发明为了进一步阐明补骨脂素与五味子活性成分联用减毒机制，利用metascape数据库对上述56个共同靶点进行go分析与kegg通路分析。go功能富集分析结果显示(图4)，在与主要活性成分作用相关的生物过程方面注释结果(p＜0.01)，主要涉及到激酶活性的正调控、负调控凋亡过程、mapk级联等过程；在细胞成分(cc)方面共获得47条注释结果，abl1的细胞成分之一是细胞质的核周区，与肝毒性中pi3k-akt-mtor信号通路的表达密切相关，证实了核心靶点abl1选择的准确性。在分子功能(mf)方面共获得88条注释结果，核心靶点abl1受蛋白激酶活性和跨膜受体蛋白丝氨酸，蛋白质结构域特异性结合的影响，这是肝脏诱导发生的的必然过程。在生物过程(bp)中可以看出前三个生物途径都与氧化应激、细胞凋亡有关。kegg通路分析结果显示，按p值(p＜0.01)进行筛选后共获得155条信号通路，kegg网络证实其与pi3k-akt-mtor、mapk等信号通路密切相关，进一步证实了此通路的核心和关键(图5)。利用cytoscape 3.7.2软件建立五味子的“疾病-成分-靶点-通路”网络(图6所示)，可直观地显示出18个活性成分、61个靶蛋白、前20条通路与肝毒性之间的潜在关联。如图7和图8所示，韦恩图富集补骨脂素与18个五味子成分得到29个共同靶点和12条共同通路，并利用cytoscape3.7.2软件构建补骨脂素与五味子成分的“疾病-成分-共同靶点-共同通路”网络图(图9)，可直观显示出五味子活性成分与补骨脂素联用减毒的共同靶点和信号通路。
[0084]
2.4分子对接筛选潜在五味子成分
[0085]
abl1蛋白与18个活性成分进行分子对接，观察配体相应的打分值，该值越小对接结果越佳。小于-4.25kcal
.
mol-1
是配体与靶点间有结合活性，小于-5.0kcal
.
mol-1
是结合活
性较佳，小于-7.0kcal
.
mol-1
是有强烈对接活性。本发明分子对接结果：如图10-11所示，leu354、val289等残基与五味子丙素中苯环及末端氢键形成pi-aklyl作用力，asp381残基与五味子丙素中的苯环形成pi作用力。
[0086]
如图10显示，val289、met290残基与五味子乙素中的苯环及氢键形成pi-aklyl作用力，glu286残基与五味子乙素的末端形成氢键相互作用力(图10)。此外，五味子丙素与五味子乙素对接结果相似，asp381残基也与五味子乙素中的苯环形成pi作用力(图11)。因此，初步筛选得到五味子丙素、五味子乙素两个活性成分做为后续研究。
[0087]
2.5spr实验比较五味子丙素与abl1与五味子乙素与abl1间的结合能
[0088]
为了证明五味子丙素与abl1比五味子乙素与abl1结合力强，本发明首先进行了表面等离子共振(spr)来研究五味子丙素/五味子乙素与abl1之间的分子亲和力。正如预期，五味子丙素/五味子乙素与固定化的abl1蛋白以剂量依赖性方式直接结合。如图12所示，五味子丙素和abl1之间相互作用的解离平衡常数(kd)约为4.930μm，如图13所示，五味子乙素与abl1之前相互作用的解离常数(kd)约为6.807μm。kd值越小，表明五味子丙素与abl1结合能强于五味子乙素与abl1结合能。因此，选取五味子丙素进行后续实验。
[0089]
2.6五味子丙素与补骨脂素联用的减毒机制分析
[0090]
前期发现补骨脂素作用直接靶点abl1，引起nrf2和mtor表达降低，可能引起肝细胞死亡，引发肝毒性。五味子丙素、五味子乙素与直接靶标abl1，靶蛋白mtor、nrf2关联紧密；分子对接及spr技术证明五味子丙素与abl1结合能最佳。五味子木质素类成分可缓解酒精性肝损伤其机制与激活nrf2/are信号通路有关。五味子丙素可通过激活nrf2通路减轻炎症氧化损伤并促进线粒体生物合成，进而保护apap诱导的肝毒性。综合分析，如图14所示，本发明推测五味子丙素与abl1结合，通过激活nrf2通路抑制氧化应激，mtor蛋白表达升高，减少细胞毒性，减轻abl1抑制剂补骨脂素引起的肝毒性，减轻肝损伤。
[0091]
2.7五味子丙素和补骨脂素对l02细胞的作用
[0092]
为了进一步探讨五味子丙素和补骨脂素对l02细胞的作用，进行了mtt试验。如图15所示，五味子丙素可降低补骨脂素诱导l02细胞毒性，由此也证明，五味子丙素可减轻补骨脂肝毒性。
[0093]
2.8五味子丙素和补骨脂素诱导alt和ast肝酶活力的影响
[0094]
如图16-17所示，500μm的补骨脂素给药后alt和ast的肝酶活性显著升高，2μm的五味子丙素处理后补骨脂素中的细胞上清alt和ast水平下降。
[0095]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.五味子丙素在制备降低补骨脂素肝毒性的药物中的应用。2.一种降低补骨脂素肝毒性的药物，其特征在于，所述药物的活性成分仅包括五味子丙素。3.五味子丙素在制备含补骨脂素的药物中的应用。4.一种降低含补骨脂素药物的肝毒性的方法，其特征在于，通过在所述药物中添加五味子丙素来降低肝毒性。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述药物中，所述五味子丙素与所述补骨脂素的摩尔比为1：250。6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括补骨脂素和降低补骨脂素肝毒性的物质，降低补骨脂素肝毒性的物质的活性成分仅包括五味子丙素。7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述五味子丙素与所述补骨脂素的摩尔比为1：250。8.一种如权利要求6或7所述的药物组合物在制备含补骨脂素的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了五味子丙素在降低补骨脂素肝毒性中的应用，涉及中药技术领域。本发明首先通过TCMSP网站及文献调研筛选“五味子”活性成分，网络药理学分析其减毒机制，随后，利用分子对接和SPR技术确定与ABL1对接能量值及结合力排名靠前的成分，明确能降低补骨脂素肝毒性的最佳活性成分，提出了一个基于毒性直接靶标的单体化学成分——五味子丙素，以降低药物不良反应的新策略。本发明从相同的毒性靶标与毒性机制角度出发，全面揭示了中药毒副作用的科学内涵及建立了科学安全风险对策，提出了基于毒性直接靶标的中药联用减毒策略和方法，推动中医药毒理学发展。中医药毒理学发展。中医药毒理学发展。


技术研发人员：李遇伯 王玉明 范思邈
受保护的技术使用者：天津中医药大学
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/7/20