一种柳杉CfNAC1基因及其表达蛋白和应用

一种柳杉cfnac1基因及其表达蛋白和应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学领域，更具体地说，涉及一种柳杉cfnac1基因及其表达蛋白和应用。


背景技术：

2.柳杉(cryptomeria fortunei)为我国特有树种，也称为中国雪松，产于浙江天目山、福建南屏三千八百坎及江西庐山等地海拔1100米以下地带。在江苏南部、浙江、安徽南部、河南、湖北、湖南、四川、贵州、云南、广西及广东等地均有栽培，生长良好。柳杉幼龄能稍耐荫，在温暖湿润的气候和土壤酸性、肥厚而排水良好的山地，生长较快；边材黄白色，心材淡红褐色，材质较轻软，纹理直，结构细，耐腐力强，易加工，为良好的工业建筑用材。目前关于柳杉nac转录因子的研究较少，缺乏可靠的理论依据基础。
3.植物中的nac转录因子的共同特征是在蛋白质的n端含有高度保守并特异的nac结构域，由约150～160个氨基酸构成，可以与dna和其他蛋白质结合，而c端具有一个高度变异的转录调控区，能激活或抑制基因转录。nac转录因子的整个n端区域可划分为5个亚结构域(a、b、c、d和e)。其中，亚结构域a可能参与功能性二聚体的形成；亚结构域c和d带正电荷，高度保守，是dna结合位点，含有核定位信号(nuclear localization signal，nls)，少数nac蛋白在亚结构域d有一个负调控结构域(negative reg-ulatory domain，nrd)，可以抑制转录活性；亚结构域b和e可能与nac基因的功能多样性有关。c末端为转录调控区，是一段序列较为简单的区域，常包含丝氨酸-苏氨酸、脯氨酸-谷氨酰胺或一些酸性氨基酸的重复序列，这导致c端的固有无序化，使其缺乏稳定的三维立体结构。尽管nac转录因子的c端区域差异很大，但一些不同物种的nac蛋白trr有特定的基序，在特定nac亚家族的某些亚群是保守的。结构的多样性使得nac转录因子具有各种各样的功能，使nac转录因子几乎在植物的每个生长发育阶段和各种胁迫条件下都发挥着重要的调控作用，包括生物和非生物胁迫响应(外源激素响应、病原菌侵袭和外界不良环境干扰)、花青素合成、胚胎发育、生长素信号转导、木质素合成、次生木质部发育和次生壁的形成等。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种柳杉cfnac1基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种柳杉cfnac1基因的表达蛋白和应用。本发明还要解决的另一技术问题在于提供一种柳杉cfnac1基因的应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种柳杉cfnac1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.柳杉cfnac1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.含有权利要求1所述的柳杉cfnac1基因的载体。
9.所述的载体是植物表达载体。
10.所述的植物表达载体是双元植物重组表达载体35s：：cfnac1。
11.柳杉cfnac1基因在提高烟草植株中木质素含量和/或促进烟草植株中次生木质部发育和/或促进烟草植株中次生壁增厚中的应用。
12.所述的柳杉cfnac1基因在提高烟草植株中木质素含量和/或促进烟草植株中次生木质部发育和/或促进烟草植株中次生壁增厚中的应用，包括以下步骤：
13.(1)构建柳杉cfnac1基因的载体；
14.(2)将所构建的柳杉cfnac1基因的载体转化到本氏烟草的下表皮中；
15.(3)培育筛选得到木质素含量提高和/或次生木质部发育和/或次生壁增厚的烟草植株
16.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
17.本发明公开的柳杉cfnac1基因具有促进次生木质部发育和次生壁增厚以及提高木质素含量的作用，与野生型相比，转柳杉cfnac1基因的烟草植株木质素含量显著上升；组织化学染色结果表明：与野生型相比，转cfnac1植株的次生木质部区域显著增厚，且木质部细胞排列紧密；此外，次生壁厚度观察结果显示：与野生型相比，转cfnac1植株的次生细胞壁显著增厚。柳杉cfnac1具有促进次生木质部发育和次生壁增厚以及提高木质素含量的作用。
附图说明
18.图1是pcambia1302和pbi121过表达载体图；
19.图2是柳杉cfnac1基因的亚细胞图；
20.图3是野生型和柳杉转录因子35s：：cfnac1转基因植株木质素含量图，wt表示野生型木质素含量，35s：：cfnac1表示转35s：：cfnac1基因植株木质素含量；
21.图4是野生型和柳杉转录因子35s：：cfnac1转基因植株的次生木质部发育图；wt表示野生型，35s：：cfnac1表示转35s：：cfnac1基因植株；
22.图5是野生型和柳杉转录因子35s：：cfnac1转基因植株的次生壁厚度图，图左表示野生型，图右表示转35s：：cfnac1植株。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
24.实施例1：柳杉转录因子cfnac1基因的克隆
25.1、rna提取
26.本发明所使用的实验材料为柳杉形成层组织：于2022年6月20日采自南京林业大学花房一株长势良好的植株，rna的提取使用百泰克生物技术公司的离心柱型rna提取试剂盒进行提取，后进行质量及浓度检测。
27.2、cdna第一链的合成和反转录pcr
[0028][0029]
3、柳杉cfnac1基因克隆
[0030]
设计cfnac1基因的上下游引物cfnac1-f和cfnac1-p作为扩增反应的引物，引物序列如下：
[0031]
cfnac1-f：5
′‑
atgactctgtcagttaacgg-3
′
，
[0032]
cfnac1-r：5
′‑
ttacttgccaaaattccac-3
′
。
[0033][0034]
反应结束后，pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离得到长约1107bp。纯化回收后测序，测序结果如seq id no.1所示，核苷酸序列长度为1107bp，其编码蛋白序列如seq id no.2所示，由375个氨基酸组成的蛋白质。
[0035]
实施例2：柳杉cfnac1基因表达载体的构建与功能验证
[0036]
1、本发明所使用的亚细胞载体为pcambia1302，过表达载体为pbi121，。本发明所使用的内切酶为bamh i酶、ecor i、xba i酶(亚细胞定位的内切酶为bamh i酶和ecor i；过表达的内切酶为bamh i酶和xba i酶)。设计同源重组亚细胞定位的引物序列如下：
[0037]
cfnac1-f：5
′‑
tatgaccatgattacgaattcatgactctgtcagttaacgg-3
′
，
[0038]
cfnac1-r：5
′‑
caggtcgactctagaggatccttacttgccaaaattccac-3
′
。
[0039]
过表达的引物序列如下：
[0040]
cfnac1-f：5
′‑
gagaacacgggggactctagaatgactctgtcagttaacgg-3
′
，
[0041]
cfnac1-r：5
′‑
ggactgaccacccggggatccttacttgccaaaattccac-3
′
。
[0042]
双酶切反应如下：
[0043][0044]
重组反应如下：
[0045][0046][0047]
测序验证后，回收纯化重组反应后的目的载体，即得目的基因的双元植物重组表达载体35s：：cfnac1(图1)。
[0048]
2、转化农杆菌gv3101
[0049]
(1)取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或者手心融化至冰水混合状态后插入冰中；
[0050]
(2)在100μl感受态细胞中加入0.01-1μg质粒dna(转化效率高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量)，用手轻弹拨打混匀；
[0051]
(3)依次置于冰上冰浴5min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
[0052]
(4)加入700μl lb液体培养基(不含任何抗生素)，于28℃、200rpm，摇菌振荡3h；
[0053]
(5)6000rpm离心1min；
[0054]
(6)弃部分上清，留取约100-120μl菌液，轻轻吹打混匀重悬菌块，涂布于含相应抗生素的lb(kan+)固体平板上，静置15min，待表面菌液晾干；
[0055]
(7)倒置放于28℃培养箱暗培养42-48h；
[0056]
(8)pcr检测阳性菌落，4℃保存，用于后续对烟草的转基因侵染。
[0057]
3、农杆菌活化与侵染
[0058]
(1)将阳性检测正确的农杆菌菌液活化扩繁，放入100ml无菌锥形瓶中，按照1∶50稀释至50ml lb液体培养基中(kan+rif)，28℃、200rpm培养36-48h，直至菌液颜色浑浊，od值a600为1.0左右；
[0059]
(2)将该菌液转入无菌离心管中，于室温条件下，5000rpm离心10min，弃上清，菌体
用1/2ms或ms液体培养基重悬，稀释至a600＝0.6，用于转化；
[0060]
(3)将稀释后的菌液放入恒温摇床，28℃、200rpm培养30min，用于侵染。
[0061]
4、亚细胞定位观察
[0062]
(1)用1ml不含针头的注射器吸取农杆菌重悬液，注射本氏烟草的下表皮，轻轻推动活塞使农杆菌菌液缓慢侵润整个烟草叶片；
[0063]
(2)侵染后暗培养1d，光培养2d，然后使用激光共聚焦显微镜进行观察。
[0064]
(3)结果如图2所示，可以看到在细胞核中具有明显的绿色荧光信号，其他区域无信号，符合nac转录因子在细胞核中发挥生物学功能的描述。
[0065]
5、烟草叶盘介导侵染
[0066]
(1)预培养：于超净台中，将野生型不具有抗性的烟草叶片剪成约1cm
×
1cm的叶盘，暗培养2-3d，待叶片边缘卷曲；
[0067]
(2)共培养：将叶盘放入稀释过的菌液中，浸泡振荡侵染10-15min，取出叶盘放于无菌滤纸上吸走多余菌液，将侵染后的叶盘放入不含任何抗生素的ms固体培养基上(培养基上平铺一层无菌滤纸)，28℃暗培养2-3d；
[0068]
(3)分化培养：将黑暗中共培养的叶盘转移到分化培养基(ms培养基，2.0mg/l 6-ba，0.05mg/l naa，50mg/l kan，100mg/l tmt)中进行分化培养；
[0069]
(4)筛选培养：将20-25d左右分化的愈伤组织重新接入到筛选培养基(ms培养基，2.0mg/l 6-ba，0.05mg/l naa，50mg/l kan，150mg/l tmt)中，继续分化出不定芽；
[0070]
(5)壮苗培养：约2-3周后，待不定芽长至1cm左右时切下，转移到壮苗培养基(ms培养基，1.0mg/l 6-ba，0.1mg/l naa，50mg/l kan，200mg/l tmt)中进行壮苗培养；
[0071]
(6)生根培养：待不定芽长至1-2cm时放入生根培养基(1/2ms培养基，200mg/l tmt)中约10-15d长出不定根，将根系生长良好的无菌幼苗炼苗4-5d后即可转入土中培养；
[0072]
(7)同时设定未经农杆菌侵染的野生型烟草叶盘作为阴性对照。
[0073]
6、转基因植株组织化学染色
[0074]
(1)收集成熟野生型和转基因植株的烟草茎干靠近基部区域，使用徕卡切片机切成薄片；
[0075]
(2)间苯三酚配方；先配置一个用乙醇溶解的5％的间苯三酚溶液，然后与浓盐酸、水(v/v/v＝1∶1∶1)混合使用；
[0076]
(3)将混合液滴在切片上，静置30s，后置于显微镜载物台上观察拍照。
[0077]
7、转基因植株表型观察及指标测定
[0078]
对阳性克隆植株进行木质素含量检测、次生木质部组织化学染色和次生壁环境扫描电镜观察。结果如图3所示，与野生型相比，转cfnac1植株的木质素含量显著上升；结果如图4-5所示，组织化学染色结果表明，与野生型相比，转cfnac1植株的次生木质部区域显著增厚，且木质部细胞排列紧密；与野生型相比，转cfnac1植株的次生细胞壁显著增厚。综上：通过组织化学染色观察、木质素含量及次生壁厚度测定结果表明，柳杉cfnac1具有促进次生木质部发育和次生壁增厚以及提高木质素含量的作用。

技术特征：
1.一种柳杉cfnac1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述的柳杉cfnac1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。3.含有权利要求1所述的柳杉cfnac1基因的载体。4.根据权利要求3所述的含有柳杉cfnac1基因的载体，其特征在于，所述的载体是植物表达载体。5.根据权利要求4所述的含有柳杉cfnac1基因的载体，其特征在于，所述的植物表达载体是双元植物重组表达载体35s：：cfnac1。6.权利要求1所述的柳杉cfnac1基因在提高烟草植株中木质素含量和/或促进烟草植株中次生木质部发育和/或促进烟草植株中次生壁增厚中的应用。7.根据权利要求6所述的柳杉cfnac1基因在提高烟草植株中木质素含量和/或促进烟草植株中次生木质部发育和/或促进烟草植株中次生壁增厚中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建柳杉cfnac1基因的载体；(2)将所构建的柳杉cfnac1基因的载体转化到本氏烟草的下表皮中；(3)培育筛选得到木质素含量提高和/或次生木质部发育和/或次生壁增厚的烟草植株。

技术总结
本发明公开了一种柳杉CfNAC1基因及其表达蛋白和应用，属于植物分子生物学领域。本发明的柳杉CfNAC1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；本发明以柳杉形成层组织为材料，通过克隆得到柳杉CfNAC1基因，在此基础上构建其过量表达载体双元植物重组表达载体35S：：CfNAC1，转入本氏烟草的下表皮中，得到转基因植株，基因功能鉴定结果表明柳杉CfNAC1基因是促进次生木质部发育和次生壁增厚以及提高木质素含量的重要转录因子，在植物生长发育以及育种方面具有很好的应用前景。好的应用前景。好的应用前景。


技术研发人员：徐进 杨俊杰
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/7/21