CDH17特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法及应用

cdh17特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法及应用
技术领域：
：1.本发明涉及肿瘤诊断与治疗的分子影像、核医学和纳米抗体
技术领域：
：，尤其是涉及cdh17特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法及应用。
背景技术：
：：2.1993年比利时科学家hamers等人在《nature》杂志中首次报道在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体(nature.1993；363(6428):446-8.)，这种具有特殊结构域的抗体即为重链抗体(heavy-chainantibodies,hcabs)。通过分子生物学手段，克隆重链抗体的可变区即可得到只有重链可变区的抗原结合片段，即为纳米抗体(vhh，variabledomainofheavychainofheavychainantibody)。vhh晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量只有15kda，因此也被称为纳米抗体(ablynx公司注册商品名)。纳米抗体是目前已知的可结合目标抗原的最小抗体单位，具有亲和力高、分子量小、制备成本低廉(既可以运用大肠杆菌表达，也可以运用酵母、中国仓鼠卵巢细胞等真核表达体系表达)、易于临床转化和推广应用的优点。3.纳米抗体是近年来构筑分子影像探针的热门靶向载体(theranostics.2014；4(4):386-98；jnuclmed.2022oct；63(10):1705-1709)。目前，多种短半衰期核素已用于标记纳米抗体，制备纳米抗体分子影像探针。锝-99m(99mtc；t1/2＝6.02h)标记靶向程序性死亡配体1(pd-l1)的纳米抗体探针已成功转化至临床，用于非小细胞肺癌患者的无创诊断(jnuclmed.2019；60(9):1213-1220.)；镓-68(68ga；t1/2＝1.1h)标记靶向人类表皮生长因子受体(her2)的纳米抗体探针也已成功转化至临床，用于乳腺癌的无创诊断(jnuclmed.2016；57(1):27-33.)。以上实例说明放射性核素标记纳米抗体探针极具临床转化应用前景，可用于人类恶性肿瘤的早期无创诊断、关键致病靶点的可视化、单克隆抗体(mab)治疗患者的筛选以及单克隆抗体治疗后疗效评价。4.肝肠钙粘蛋白cdh17为钙依赖膜相关蛋白，是钙粘蛋白超家族的一员。cdh17具有七个细胞外结构域、一个跨膜区及一个短细胞质结构域，该短细胞质结构域与经典钙粘蛋白高度保守的细胞质结构域无同源性。与经典钙粘蛋白不同，cdh17并不诱导β连环蛋白表达上调和肌动蛋白细胞骨架重组，其粘附特性主要由细胞外结构域决定。正常情况下，cdh17主要表达于成人小肠及结肠肠上皮中，在器官发育和维持组织完整性及肠肽转运上有重要作用。近年来研究发现，cdh17异常表达与许多消化道肿瘤的高发生率显著相关。在肝癌中，约80％的患者cdh17表达升高，且分布于细胞膜和细胞质中。除了表达量的增加，肝癌细胞中还存在异常剪接体，比如外显子7缺失的cdh17。在正常胃上皮细胞中cdh17不表达，而在胃癌尤其是肠型胃癌中cdh17过表达，与不良病理特征如组织学分期、肿瘤浸润和淋巴结转移等密切相关，是预测肿瘤进展和预后的重要指标。对于原发性结直肠癌，有研究表明cdh17表达下调能够抑制结肠癌细胞的侵袭与转移，且通过组织芯片分析发现，cdh17在结直肠腺癌中过表达，为诊断结直肠腺癌的免疫组织化学标记物且敏感度优于cdx2。在治疗上，当cdh17受抑制时，β连环蛋白和磷酸化糖原合成激酶3β(gsk-3β)合成减少及定位idno.7所示的氨基酸序列的cdr2和具有seqidno.8所示的氨基酸序列的cdr3。11.更具体地，本发明的cdh17特异性纳米抗体具有seqidno.4或9所示的氨基酸序列。12.在本发明中，为了简便起见，将具有seqidno.4或9所示的氨基酸序列的cdh17特异性纳米抗体分别称为cdh1或cdh2。13.如本文所用，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的结构。纳米抗体可在n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domainantibody,sdab)或vhh(variabledomainofheavychainofheavychainantibody)，它们可互换使用。14.在一些实施方案中，本发明还涵盖如本文所述的cdh17特异性纳米抗体的抗原结合片段。15.如本文中所使用的，术语“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文以用于所有目的。可通过重组dna技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。16.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。17.在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。18.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个cdr，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883)或imgt编号系统(lefranc等人,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefranc等人,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。19.如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。20.如本文中所使用的，术语“cdh17特异性”是指特异性结合cdh17。21.如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以由该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。22.两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见malmqvistm,nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数kd(参见davies等人,annualrevbiochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(spr)在biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或kinexa来测量解离常数。23.在一些实施方案中，本发明还提供了如本文所述的cdh17特异性纳米抗体的变体，其与seqidno.4或9所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且基本保留了其所源自的纳米抗体的生物学功能(例如特异性结合cdh17的生物活性)。24.更具体地，所述变体与如本文所述的cdh17特异性纳米抗体相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、至多5个或至多1个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换。25.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。26.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。27.cdh17特异性纳米抗体融合蛋白28.在另一个方面，本发明提供了一种cdh17特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如本文所述的纳米抗体和白蛋白结合域。29.更具体地，所述白蛋白结合域具有seqidno.11或12所示的氨基酸序列。30.本发明所提供的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白中，如本文所述的纳米抗体和白蛋白结合域可以设有连接肽。所述连接肽可以是通过由丙氨酸(a)和/或丝氨酸(s)和/或甘氨酸(g)组成的柔性多肽链，连接肽的长度可以为3～30个氨基酸，例如3-9个、9-12个、12-16个或16～20个氨基酸。31.在具体的实施方案中，本发明提供了一种cdh17特异性纳米抗体融合蛋白，其具有seqidno.13或15所示的氨基酸序列。32.在本发明中，为了简便起见，将具有seqidno.13或15所示的氨基酸序列的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白分别称为acdh17.1或acdh17.2。33.多核苷酸34.在另一个方面，本发明还提供了编码上述纳米抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白的多核苷酸。35.更具体地，所述多核苷酸具有seqidno.5、10、14或16所示的核苷酸序列。36.更具体地，编码如本文所述的cdh17特异性纳米抗体的多核苷酸具有seqidno.5或10所示的核苷酸序列。更具体地，编码如本文所述的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸具有seqidno.14或16所示的核苷酸序列。37.本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。38.术语“编码多肽/蛋白/抗体的多核苷酸”可以是包括编码此多肽/蛋白/抗体的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。39.本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选地至少70％，更优选地至少80％，最优选至少90％同一性的多核苷酸，并且它们编码的多肽/蛋白/抗体具有基本上相同的功能和活性。本发明特别涉及可在严格条件下与本发明所述多核苷酸杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在90％以上,更优选95％以上时才发生杂交。40.本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。41.载体42.在另一个方面，本发明还提供了包含编码上述纳米抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白的多核苷酸的载体。43.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。44.宿主细胞45.在另一个方面，本发明还提供了包含如本文所述的载体的宿主细胞。46.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或其他人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。47.将载体导入宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。48.本发明的纳米抗体可以单独使用，也可与可检测标记物、治疗剂、pk(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。49.可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。优选的可检测标记物为放射性核素。50.可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl)；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。223、ru-106、na-24、sr-89、tb-149、th-227、xe-133、yb-169或yb-177。70.更具体地，放射性核素选自ga-68。71.更具体地，如本文所述的cdh17特异性纳米抗体经ga-68标记(一种此类cdh17特异性分子影像探针的例子是如实施例中所述的[68ga]ga-nota-cdh1或[68ga]ga-nota-cdh2)。更具体地，如本文所述的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白经ga-68标记(一种此类cdh17特异性分子影像探针的例子是如实施例中所述的[68ga]ga-nota-acdh17.1或[68ga]ga-nota-acdh17.2)。[0072]在另一个方面，本发明还提供了制备cdh17特异性分子影像探针的方法，包括通过双功能螯合剂修饰如本文所述的cdh17特异性纳米抗体或cdh17特异性纳米抗体融合蛋白，得到放射性核素标记中间体；和使用放射性核素标记所述放射性核素标记中间体，得到cdh17特异性分子影像探针。[0073]组合物[0074]在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含如本文所述的cdh17特异性纳米抗体、cdh17特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针。所述组合物可用于可视化cdh17的表达、诊断cdh17相关肿瘤、预测cdh17相关肿瘤的进展和预后、预测cdh17相关肿瘤的治疗效果和/或治疗cdh17相关肿瘤。[0075]在一些实施方案中，所述组合物可以是药物组合物。[0076]在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。[0077]在一些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。[0078]在一些实施方案中，所述另外的药学活性剂是抗炎药物或免疫抑制剂。[0079]在一些实施方案中，在所述药物组合物中，如本文所述的cdh17特异性纳米抗体、cdh17特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，如本文所述的cdh17特异性纳米抗体、cdh17特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。[0080]在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。[0081]本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的如本文所述的cdh17特异性纳米抗体、cdh17特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针。“预防有效量”是指足以预防、阻止或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。[0082]试剂盒[0083]本发明还提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的cdh17特异性纳米抗体、cdh17特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针。[0084]所述试剂盒可用于可视化cdh17的表达、诊断cdh17相关肿瘤、预测cdh17相关肿瘤的进展和预后、预测cdh17相关肿瘤的治疗效果和/或治疗cdh17相关肿瘤。[0085]所述试剂盒还可包含还包括容器、使用说明书、以及实际应用所需的其他试剂和缓冲液，例如用于溶解样本的裂解介质，各种缓冲液，检测标记，检测底物等。[0086]诊断和治疗应用[0087]本发明的cdh17特异性纳米抗体对cdh17具有极高的亲和力，因而可以用于可视化cdh17的表达、诊断cdh17相关肿瘤、预测cdh17相关肿瘤的进展和预后、预测cdh17相关肿瘤的治疗效果和/或治疗cdh17相关肿瘤。[0088]特别地，由本发明的cdh17特异性纳米抗体制备的cdh17特异性分子影像探针具有亲和力显著提高、正常组织摄取非特异性摄取明显降低、且图像质量明显提高的特点，可用于无创、精准、高效探测人cdh17的表达，因此特别适合用于诊断cdh17相关的肿瘤和预测cdh17相关肿瘤的治疗效果。在选择合适的放射性核素进行偶联后，也可以用于精准治疗cdh17相关肿瘤。[0089]因此，在另一个方面，本发明还涉及如本文所述的cdh17特异性纳米抗体、cdh17特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针在制备用于可视化cdh17的表达、诊断cdh17相关肿瘤、预测cdh17相关肿瘤的进展和预后、预测cdh17相关肿瘤的治疗效果和/或治疗cdh17相关肿瘤的试剂盒或药物中的用途。[0090]如本文所用，cdh17相关的肿瘤可以包括本领域熟知的各种肿瘤或癌症。例如，cdh17相关的肿瘤可以包括消化道肿瘤，例如胃癌、肝癌、小肠癌、结直肠癌、大肠癌、胰腺癌、食管癌等。[0091]本发明的有益效果[0092]本发明所公开的cdh17特异性分子影像诊疗一体化体系，即[68ga]ga-nota-cdh1、[68ga]ga-nota-cdh2、[68ga]ga-nota-acdh17.1和[68ga]ga-nota-acdh17.2免疫pet显像探针实现了对人cdh17分子表达的无创可视化，进一步实现了结直肠癌的无创诊断；所述探针具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，并且易于临床转化等优点；通过筛选cdh17高表达的患者，进一步开展cdh17特异性放射免疫治疗，从而实现cdh17表达阳性肿瘤的靶点特异性诊疗一体化。附图说明[0093]图1显示了sds-page测定纳米抗体cdh1和cdh2表达情况的结果。[0094]图2显示了sds-page测定纳米抗体融合蛋白acdh17.1和acdh17.2表达情况的结果。[0095]图3显示了人结直肠腺癌细胞系caco2中cdh17表达的免疫组化染色结果。[0096]图4显示了纳米抗体cdh1和cdh2以及纳米抗体融合蛋白acdh17.1和acdh17.2与人cdh17的亲和力测定的结果。[0097]图5显示了纳米抗体融合蛋白acdh17.1和acdh17.2与人血清白蛋白及小鼠血清白蛋白的亲和力测定的结果。[0098]图6显示了本发明的cdh17特异性分子影像探针[68ga]ga-nota-cdh1、[68ga]ga-nota-cdh2、[68ga]ga-nota-acdh17.1及[68ga]ga-nota-acdh17.2的放射化学纯度测定结果。[0099]图7显示了[68ga]ga-nota-cdh1免疫pet显像诊断结直肠癌的实验结果。[0100]图8显示了[68ga]ga-nota-cdh2免疫pet显像诊断结直肠癌的实验结果。[0101]图9显示了[68ga]ga-nota-acdh17.1和[68ga]ga-nota-acdh17.2在caco2结直肠腺癌模型中的多时间点pet/ct显像结果。[0102]图10显示了[68ga]ga-nota-acdh17.1和[68ga]ga-nota-acdh17.2在caco2结直肠腺癌模型pet/ct显像中的roi结果。[0103]图11显示了[68ga]ga-nota-acdh17.1和[68ga]ga-nota-acdh17.2在caco2结直肠腺癌模型pet/ct显像中的体外分布数据图。[0104]图12比较了[68ga]ga-nota-cdh1、[68ga]ga-nota-acdh17.1及[68ga]ga-nota-acdh17.2探针在结直肠腺癌模型pet/ct显像中的roi及体外生物分布数据。[0105]图13显示了免疫组织化学染色验证肿瘤内部cdh17的表达的结果。具体实施方式[0106]以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
：常规试剂、方法和设备。[0107]实施例1：cdh17特异性纳米抗体及其融合蛋白的制备[0108]按照发明人前期公布的方法(参考发明创造名称“一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针”的专利号zl202011131233.7的专利，其通过引用整体并入本文)，将新型cdh17特异性单价纳米抗体cdh1(seqidno.5)、cdh2(seqidno.10)、纳米抗体融合蛋白acdh17.1(seqidno.14)及acdh17.2(seqidno.16)的基因序列分别克隆到pet-30a(+)表达载体并在大肠杆菌(e.coli)中重组表达。[0109]sds-page测定纳米抗体cdh1和cdh2表达情况的结果如图1所示；sds-page测定纳米抗体融合蛋白acdh17.1和acdh17.2表达情况的结果如图2所示。[0110]实施例2：建立cdh17表达阳性荷瘤小鼠模型[0111]以抗人cdh17单克隆抗体(santacruzbiotechnology,sc-393533)作为一抗，通过免疫组化染色发现人结直肠腺癌细胞系caco2cdh17表达阳性，人结直肠腺癌细胞系ls174tcdh17表达阴性，如图3所示。分别将1×106个caco2及ls174t细胞接种于ncg(nod-prkdcem26cd52il2rgem26cd22/nju)小鼠右侧肩部建立皮下结直肠腺癌细胞株移植瘤模型。[0112]实施例3：cdh17特异性纳米抗体及其融合蛋白的亲和力[0113]纳米抗体cdh1和cdh2与人cdh17亲和力测定结果如图4所示，kd值分别为1.024nm和181.6nm；纳米抗体融合蛋白acdh17.1和acdh17.2与人cdh17亲和力测定结果如图4所示，kd值分别为71.49nm和181.0nm；纳米抗体融合蛋白acdh17.1与人血清白蛋白及小鼠血清白蛋白亲和力测定如图5所示，kd值分别为120.9pm和443.4pm；纳米抗体融合蛋白acdh17.2与人血清白蛋白及小鼠血清白蛋白亲和力测定如图5所示，与人血清白蛋白不结合，与鼠血清白蛋白结合kd值为3.185nm。[0114]实施例4：cdh17特异性分子影像探针的制备[0115]p-scn-bn-nota修饰cdh1、cdh2、acdh17.1及acdh17.2制备中间体nota-cdh1、cdh1和[68ga]ga-nota-cdh2在体内的分布情况，此外，体外生物分布实验结果进一步揭示了探针在体内主要组织器官的分布情况。上述结果表明[68ga]ga-nota-cdh1和[68ga]ga-nota-cdh2探针可无创可视化cdh17表达。[0120]实施例6：基于cdh17特异性纳米抗体融合蛋白的cdh17特异性分子影像探针免疫pet显像诊断结直肠癌[0121][68ga]ga-nota-acdh17.1和[68ga]ga-nota-acdh17.2免疫pet显像诊断结直肠癌，实验结果如图9所示，[68ga]ga-nota-acdh17.1和[68ga]ga-nota-acdh17.2在caco2结直肠腺癌模型中的多时间点pet/ct显像。cdh17特异性纳米抗体融合蛋白探针[68ga]ga-nota-acdh17.1和[68ga]ga-nota-acdh17.2在肿瘤组织仍然有较高的摄取。如图10roi数据所示，肿瘤部位的摄取在4小时内随时间延长逐渐增加。图11所示体外分布数据进一步证实了探针在肿瘤部位的富集。通过进一步比较[68ga]ga-nota-cdh1、[68ga]ga-nota-acdh17.1及[68ga]ga-nota-acdh17.2两类探针在结直肠腺癌模型pet/ct显像中的roi及体外生物分布数据，表明纳米抗体融合蛋白探针并不影响其对于肿瘤内部cdh17无创可视化的能力，实验结果如图12所示。更进一步，利用cdh17特异性抗体(santacruzbiotechnology,sc-393533)对肿瘤开展免疫组织化学染色，证实了肿瘤内部cdh17的表达，如图13所示。[0122]需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本技术实现要素：的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种cdh17特异性纳米抗体，其特征在于，包含：(1)具有seq id no.1所示的氨基酸序列的cdr1、具有seq id no.2所示的氨基酸序列的cdr2和具有seq id no.3所示的氨基酸序列的cdr3，或(2)具有seq id no.6所示的氨基酸序列的cdr1、具有seq id no.7所示的氨基酸序列的cdr2和具有seq id no.8所示的氨基酸序列的cdr3，优选地，所述cdh17特异性纳米抗体具有seq id no.4或9所示的氨基酸序列。2.一种cdh17特异性纳米抗体融合蛋白，其特征在于，包含根据权利要求1所述的纳米抗体和白蛋白结合域，优选地，所述白蛋白结合域具有seq id no.11或12所示的氨基酸序列，优选地，所述cdh17特异性纳米抗体融合蛋白具有seq id no.13或15所示的氨基酸序列。3.一种多核苷酸，其特征在于，编码根据权利要求1所述的cdh17特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白，优选地，所述多核苷酸具有seq id no.5、10、14或16所示的核苷酸序列。4.一种载体，其特征在于，包含根据权利要求3所述的多核苷酸。5.一种宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求4所述的载体。6.一种cdh17特异性分子影像探针，其特征在于，包含经放射性核素标记的根据权利要求1所述的cdh17特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白。7.根据权利要求6所述的分子影像探针，其特征在于，根据权利要求1所述的cdh17特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白经由双功能螯合剂被放射性核素标记，优选地，所述双功能螯合剂选自p-scn-bn-nota，优选地，所述放射性核素选自tc-99m、ga-68、f-18、i-123、i-125、i-131、i-124、in-111、ga-67、cu-64、zr-89、c-11、lu-177、re-188、y-86、mn-52、sc-44、lu-177、y-90、ac-225、at-211、bi-212、bi-213、cs-137、cr-51、co-60、dy-165、er-169、fm-255、au-198、ho-166、i-125、i-131、ir-192、fe-59、pb-212、mo-99、pd-103、p-32、k-42、re-186、re-188、sm-153、ra-223、ru-106、na-24、sr-89、tb-149、th-227、xe-133、yb-169或yb-177，优选地，所述放射性核素选自ga-68。8.一种制备cdh17特异性分子影像探针的方法，其特征在于，包括通过双功能螯合剂修饰根据权利要求1所述的cdh17特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白，得到放射性核素标记中间体；和使用放射性核素标记所述放射性核素标记中间体，得到cdh17特异性分子影像探针，优选地，所述双功能螯合剂选自p-scn-bn-nota，优选地，所述放射性核素选自tc-99m、ga-68、f-18、i-123、i-125、i-131、i-124、in-111、ga-67、cu-64、zr-89、c-11、lu-177、re-188、y-86、mn-52、sc-44、lu-177、y-90、ac-225、at-211、bi-212、bi-213、cs-137、cr-51、co-60、dy-165、er-169、fm-255、au-198、ho-166、i-125、i-131、ir-192、fe-59、pb-212、mo-99、pd-103、p-32、k-42、re-186、re-188、sm-153、ra-223、ru-106、na-24、sr-89、tb-149、th-227、xe-133、yb-169或yb-177，优选地，所述放射性核素选自ga-68。
9.一种用于可视化cdh17的表达、诊断cdh17相关肿瘤、预测cdh17相关肿瘤的进展和预后、预测cdh17相关肿瘤的治疗效果和/或治疗cdh17相关肿瘤的试剂盒或组合物，其特征在于，包含根据权利要求1所述的cdh17特异性纳米抗体、根据权利要求2所述的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白、根据权利要求3所述的多核苷酸、根据权利要求4所述的载体、根据权利要求5所述的宿主细胞或根据权利要求6-8中任一项所述的分子影像探针。10.根据权利要求1所述的cdh17特异性纳米抗体、根据权利要求2所述的cdh17特异性纳米抗体融合蛋白、根据权利要求3所述的多核苷酸、根据权利要求4所述的载体、根据权利要求5所述的宿主细胞或根据权利要求6-8中任一项所述的分子影像探针在制备用于可视化cdh17的表达、诊断cdh17相关肿瘤、预测cdh17相关肿瘤的进展和预后、预测cdh17相关肿瘤的治疗效果和/或治疗cdh17相关肿瘤的试剂盒或药物中的用途。

技术总结
本发明涉及肿瘤诊断与治疗的分子影像、核医学和纳米抗体技术领域，尤其是涉及CDH17特异性诊疗一体化分子影像探针的制备方法及应用。本发明的CDH17特异性分子影像探针实现了对人CDH17分子表达的无创可视化，进一步实现了结直肠癌的无创诊断；所述探针具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，并且易于临床转化等优点；通过筛选CDH17高表达的患者，进一步开展CDH17特异性放射免疫治疗，从而实现CDH17表达阳性肿瘤的靶点特异性诊疗一体化。的靶点特异性诊疗一体化。的靶点特异性诊疗一体化。


技术研发人员：魏伟军 潘心冰 刘建军
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属仁济医院
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/7/22