人参皂苷F5在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用

人参皂苷f5在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术和医药技术领域，具体涉及人参皂苷f5在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。


背景技术：

2.动脉粥样硬化(as)是一种涉及内皮细胞功能障碍、巨噬细胞炎症以及血管平滑肌细胞(vsmc)增殖之间相互作用的系统性动脉疾病。在动脉粥样硬化的发展过程中，脂质、纤维组织、炎性细胞以及vsmc逐渐沉积在动脉内膜上形成了动脉粥样硬化斑块。在动脉粥样硬化的早期阶段，一般没有明显的症状，但随着病情的进展，斑块逐渐侵入血管腔内，阻碍了血管的正常血流，临床上表现为冠状动脉疾病、中风、短暂性缺血发作和周围动脉疾病。
3.notch信号的传导由高度保守的受体-配体介导，在调控细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥关键作用。相邻notch受体与配体相互作用，经过adam金属蛋白酶以及γ分泌酶的酶切，释放出notch受体的胞内域(nicd)进入细胞核，rbpj与nicd结合，招募其余的共转录因子实现下游靶基因hes1、hes5、hey1、hey2的调控。
4.在高脂饮食诱导的apoe-/-小鼠主动脉中观察到notch下游基因hes1、5、7以及hey1、hey2高表达，说明notch信号通路在as的发生发展中异常激活，与as的疾病发展具有正相关；使用γ-分泌酶抑制剂dapt通过抑制notch信号通路及其下游靶基因的表达，可减少巨噬细胞活性及斑块形成。γ-分泌酶抑制剂通过抑制notch受体的酶切来阻断notch信号，但是γ-分泌酶与多条信号通路相互作用，抑制γ-分泌酶会抑制多种信号通路，导致γ分泌酶抑制剂的临床试验产生非常严重的毒副作用。而选用可直接作用于notch信号通路的关键转录因子rbpj作为靶点，有望避免γ分泌酶抑制剂所产生的问题。然而已开发的rbpj抑制剂很少，因此开发结构多样性的rbpj转录因子的小分子抑制剂实现抗动脉粥样硬化具有重要意义。
5.计算机辅助药物筛选可以大幅度降低新药研发的成本及时间，虚拟筛选技术也逐渐成为计算机辅助药物设计的核心技术之一。虚拟筛选是基于靶点蛋白的构象或基于活性小分子配体的结构，对构建的化合物库进行筛选并进行评分，评分高的化合物作为先导化合物再进行深入研发。现有notch信号通路抑制剂的开发较少，可参考抑制剂信息较少，虚拟筛选为notch通路抑制剂以及抗动脉粥样硬化药物的研发提供了有效的技术手段。
6.人参皂苷f5(ginsenoside f5)，cas号189513-26-6，分子量771.0g/mol，化学名(2r,3s,4s,5r,6s)-2-[[(2r,3r,4r,5s)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-6-[(2s)-6-methyl-2-[(3s,5r,6s,8r,9r,10r,12r,13r,14r,17s)-3,6,12-trihydroxy-4,4,8,10,14-pentamet hyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]hept-5-en-2-yl]oxyoxane-3,4,5-triol，分子式为c
41h70o13
，化学结构如下：
[0007][0008]
人参皂苷f5是从人生中提取出的一种糖基化三萜化合物。人参是一种传统中药，具有对脑功能的改善、治疗肿瘤、提高机体免疫能力和延缓衰老等多种用途，人参皂苷f5具有抗炎、抗肿瘤、抗肺纤维化以及抗肝硬化等生物活性。迄今为止尚未见过人参皂苷f5作为notch抑制剂调控notch信号通路实现抗动脉粥样硬化作用的相关报道。


技术实现要素：

[0009]
针对现有技术中存在不足，本发明提供了人参皂苷f5在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用；本发明研究发现人参皂苷f5能够用于制备notch信号通路抑制剂，所述人参皂苷f5能够抑制notch通路关键转录因子rbpj蛋白、改变notch协同因子或效应因子的表达/功能，从而抑制下游基因的表达，进而实现抑制as的发展进展、减少动脉粥样硬化斑块生成的目的；所述人参皂苷f5在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中具有很好的应用前景。
[0010]
为了达到上述技术目的，本发明采用以下技术手段：
[0011]
本发明首先提供了人参皂苷f5在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
[0012]
优选地，所述应用为人参皂苷f5调控notch信号通路。
[0013]
优选地，所述调控为抑制notch信号通路。
[0014]
优选地，通过以下方式抑制notch信号通路：
[0015]
(a)抑制notch通路关键转录因子rbpj蛋白；和/或
[0016]
(b)改变notch协同因子或效应因子的表达/功能。
[0017]
本发明还提供了一种预防和/或治疗动脉粥样硬化药物，所述药物的活性成分包括上述人参皂苷f5。
[0018]
本发明还提供了上述人参皂苷f5在制备rbpj蛋白抑制剂中的应用。
[0019]
本发明还提供了一种rbpj蛋白抑制剂，所述抑制剂的活性成分包括上述人参皂苷f5。
[0020]
本发明还提供了上述rbpj蛋白抑制剂在制备预防和/或治疗notch信号通路异常激活的疾病的产品中的应用。
[0021]
优选地，所述notch信号通路异常激活的疾病包括动脉粥样硬化药物。
[0022]
本发明还提供了一种notch信号通路抑制剂，所述抑制剂的活性成分包括上述人参皂苷f5。
[0023]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0024]
本发明通过分子对接筛选出可以与rbpj蛋白结合的候选化合物，并利用分子动力
学模拟方法分析候选化合物与rbpj蛋白的结合自由能。与传统研究方法相比，本发明所述方法能够有效节约成本及时间，提高筛选效率。
[0025]
本发明设计实施药理学实验，首次验证人参皂苷f5可作为notch抑制剂，通过抑制notch信号通路的激活，从而实现抗动脉粥样硬化的作用，对心血管疾病有显著的治疗作用，为拓宽notch信号通路抑制剂及抗动脉粥样硬化药物的筛选研发提供了新的途径。
附图说明
[0026]
图1为人参皂苷f5与靶向蛋白rbpj的结合示意图；其中a为人参皂苷f5与rbpj的基因相互作用图，b为人参皂苷f5与rbpj的空间相互作用图。
[0027]
图2为人参皂苷f5阻断蛋白rbpj与dna结合的示意图，其中a为正视图，b为侧视图。
[0028]
图3为人参皂苷f5与rbpj的rmsd图。
[0029]
图4为不同浓度人参皂苷f5在巨噬细胞中增殖影响图；其中，与空白组比较，mean
±
sd，n＝3，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。
[0030]
图5为人参皂苷f5在巨噬细胞中对notch下游靶基因hes家族和hey家族hes1、hes5、hey1、hey2 mrna基因表达的抑制作用图；其中，与空白组比较，mean
±
sd，n＝3，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。
具体实施方式
[0031]
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。
[0032]
实施例1：与靶点蛋白rbpj特异性结合的化合物的筛选及分析
[0033]
本实施例中采用分子对接技术及分子动力学模拟技术筛选与靶点蛋白rbpj特异性结合的化合物并分析靶点蛋白rbpj与候选化合物的相互作用，具体步骤如下所示：
[0034]
(1)化合物数据库的建立：
[0035]
从tcmsp、pubchem、bindingdb数据库以及drugbank搜集化合物，以sdf格式进行保存，建立化合物数据库。
[0036]
(2)靶点蛋白的收集：
[0037]
从pdb数据库中搜集并下载rbpj靶点蛋白的复合晶体结构，下载的文件包含其他蛋白等分子，删除水分子和其他蛋白结构，保留rbpj结构，作为分子对接用的靶点蛋白结构文件。
[0038]
(3)与靶点蛋白rbpj特异性结合的化合物的筛选：
[0039]
利用分子对接软件moe，以rbpj为对接受体，用上述步骤(1)中构建的化合物库进行分子对接，对接结果依据经过优化的结合能进行排序，再进一步叠加化合物阻断靶点蛋白rbpj与dna的结合，选取对接状态最佳的化合物即人参皂苷f5，将其用于后续分子动力学模拟和药理学分析。
[0040]
图1为人参皂苷f5与rbpj的结合示意图，左图为人参皂苷f5与rbpj的基因相互作用图，右图为人参皂苷f5与rbpj的空间相互作用图。
[0041]
图2为人参皂苷f5阻断蛋白rbpj与dna结合的示意图，左图表示人参皂苷f5结合后，dna与rbpj的结合的正面视图，右图表示人参皂苷f5结合后，dna与rbpj的结合的侧面视图。从图2可以发现，在正常情况下，rbpj与dna结合形成一个稳定的复合物，在nicd的作用下促使notch信号通路的激活。但是当人参皂苷f5结合到rbpj上时，它与rbpj发生相互作用，导致rbpj的构象发生变化，使其无法与dna正确结合，进而抑制notch信号通路的激活以及下游基因的表达。
[0042]
(4)分子动力学模拟分析人参皂苷f5与rbpj结合的稳定性与结合自由能：
[0043]
使用动力学模拟软件gromacs进行分子动力学模拟，选择gaff力场作为分子动力学模拟的力场，具体模拟过程如下所示：
[0044]
用gmx pdb2gmx命令产生复合物拓扑文件，再用gmx editconf设置边界，将人参皂苷f5与rbpj蛋白结合形成的复合物放置在正立方体盒子中，边界设置为1.1nm。随后使用gmx solvate命令向体系中添加水分子，水模型为tip3p，然后通过gmx genion向体系中添加na
+
与cl-中和系统电荷使体系处于电中性，同时使nacl终浓度为0.1m，进行1000步的能量最小化，然后再限制体系位置的条件下进行1ns的nvt与1ns的npt平衡。
[0045]
待系统平衡后，解除位置限制，对系统进行10ns的分子动力学模拟。使用gmx rms命令分别计算受体、配体以及复合物的rmsd，计算结果如图3所示，其中，rmsd值表示目标分子中的原子在模拟过程中偏离初始位置的距离，一定程度上可反映结构的稳定性。
[0046]
图3为人参皂苷f5与rbpj的rmsd图，从图中可以看出，人参皂苷f5在动力学模拟6-8ns时在0.3-0.5nm小范围内波动，动力学模拟体系中rmsd值在一定范围内的波动趋于平缓，说明动力学模拟体系稳定且数据真实可靠。
[0047]
通过分子力学/泊松玻尔兹曼表面积(mm/pbsa)方法计算结合自由能，选择结合区域的氨基酸进行结合自由能分解，结果表1所示。
[0048]
表1.小分子化合物-蛋白结合自由能
[0049]
化合物名称化合物cid号结合自由能(kj/mol)人参皂苷f546887590-37.274
[0050]
从表1可以看出，人参皂苷f5的结合自由能为-37.274kj/mol，表明人参皂苷f5与rbpj蛋白具有高度结合亲和力，能够形成稳定的复合物，阻断notch下游基因的表达。
[0051]
实施例2：人参皂苷f5抑制notch信号通路、抗动脉粥样硬化细胞的验证
[0052]
为了考察人参皂苷f5对notch通路及动脉粥样硬化的抑制效果，采用qrt-pcr检测人参皂苷f5给药后对巨噬细胞中notch信号通路下游靶基因hes1、hes5、hey1、hey2表达的影响，具体步骤如下所示：
[0053]
(1)细胞培养与传代：
[0054]
使用由dmem高糖培养基(购自hyclone)和10％胎牛血清(购自excell)配制的完全培养基培养巨噬细胞raw264.7(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，并在37℃、5％co2的条件下培养。弃去旧培养基，在培养瓶中加入3ml全新完全培养基吹散冲下贴壁的细胞，并轻轻吹打均匀，将吹打后将细胞悬液放入全新3个t25培养瓶并补充全新培养基至每瓶6-8ml/瓶。
[0055]
(2)不同浓度人参皂苷f5对巨噬细胞的增殖影响：
[0056]
将步骤(1)中的巨噬细胞raw264.7铺板于96孔板中，细胞密度为2.5
×
104个/孔，每孔100μl，待细胞培养贴壁24h后，将1μg/ml浓度的细菌脂多糖(lps)加入孔板中并设置空白对照，刺激细胞12h，随后吸弃每孔中的lps溶液，加入0.1μm、1μm、10μm、100μm浓度的人参皂苷f5，培养24h后加入cck8试剂，对0.1μm、1μm、10μm、100μm四个浓度的人参皂苷f5和空白对照组进行测定，考察不同浓度人参皂苷f5对巨噬细胞的增殖的影响，考察结果如图4所示。
[0057]
图4为不同浓度人参皂苷f5在巨噬细胞中增殖影响图；其中，与空白组比较，mean
±
sd，n＝3，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。从图中可以看出，培养24h后，与空白对照组相比，各人参皂苷f5浓度组细胞活力无下降，当给药浓度达100μm时细胞活力与空白对照组相比细胞活力无差异性，说明人参皂苷f5对巨噬细胞活力无影响，因此，选用人参皂苷f5 100μm进行后续实验。
[0058]
(3)rna提取：
[0059]
将步骤(1)中的巨噬细胞raw264.7铺板于6孔板中，细胞密度为5
×
105个/孔，每孔2ml，lps刺激12h后吸弃再加入100μm人参皂苷f5继续培养24h，待细胞汇合度达90-100％时，吸弃培养基，加入pbs清洗两遍，每孔加入lysis buffer 500μl，吹吸混匀。
[0060]
然后将细胞收集至1.5ml离心管中，加入无水乙醇500μl，上下颠倒，将液体加入离心管中，随后4000xg离心1min；向rna柱中加入500μl wash buffer随后12000xg离心1min，倒掉收集管中废液，将rna柱装回收集管，空管再次离心以清除残留的wash buffer；将柱子放在另一个干净无酶的1.5ml ep管上；在rna膜中心部位加入20-50μl的elution buffer，室温静置2min随后12000xg离心1min，将溶液再次倒入rna柱中静置5min后并再次离心得到更多rna，测定洗脱rna浓度，并保存于-80℃备用。
[0061]
(4)逆转录及荧光定量pcr：
[0062]
从步骤(3)提取的rna中取1μg总rna，根据罗氏逆转录试剂盒进行逆转录，所用qrt-pcr引物如下：
[0063]
β-actin-f：ctacctcatgaagatcctgacc(seq id no:1)；
[0064]
β-actin-r：cacagcttctctttgatgtcac(seq id no:2)；
[0065]
hey2-f：ccacctctcttctgtctctttc(seq id no:3)；
[0066]
hey2-r：ttattgtttgtcccagtgcttg(seq id no:4)；
[0067]
hey1-f：ggtctcccatctcaacaactac(seq id no:5)；
[0068]
hey1-r：gatgtgtgggtgatgtccgaa(seq id no:6)；
[0069]
hes5-f：tgcaccaggactacagcga(seq id no:7)；
[0070]
hes5-r：agtggtaaagcagcttcatctg(seq id no:8)；
[0071]
hes1-f：aatttgcctttctcatccccaa(seq id no:9)；
[0072]
hes1-r：gaaggtgacactgcgttagg(seq id no:10)。
[0073]
使用β-actin作为内参。使用depc水将引物β-actin、hes1、hes5、hey1、hey2配制为10μm溶液，以β-actin为内参基因，按照表2配制qpcr反应体系，每个样品设置3个平行复孔。将配制好的反应体系离心混匀，使用lightcycler96荧光定量pcr仪进行扩增和定量检测。按照表3设置qpcr反应程序，溶解曲线采用pcr仪推荐的程序进行设定。
[0074]
表2.qpcr反应体系
[0075]
成分体积(20μl体系)2
×
sybr green qpcr mix10μlcdna模板2μl正向引物(10μm)0.4μl反向引物(10μm)0.4μlddh2o7.2μl
[0076]
表3.qpcr反应条件
[0077] 循环数温度时间预变性195℃10分钟变性3595℃15秒退火、延伸3595℃1分钟溶解曲线1仪器默认仪器默认
[0078]
图5为人参皂苷f5在巨噬细胞中对notch下游靶基因hes家族和hey家族hes1、hes5、hey1、hey2 mrna基因表达的抑制作用图；其中，与空白组比较，mean
±
sd，n＝3，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。从图5可以看出，相较于空白对照组，人参皂苷f5组的hes1、hes5、hey1、hey2的表达显著下调。
[0079]
综上所述，表明人参皂苷f5能够作用于notch通路，并能通过抑制notch信号通路产生抗动脉粥样硬化作用，可以作为一种潜在的小分子notch抑制剂进行深入研究。
[0080]
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.人参皂苷f5在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为人参皂苷f5调控notch信号通路。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调控为抑制notch信号通路。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下方式抑制notch信号通路：(a)抑制notch通路关键转录因子rbpj蛋白；和/或(b)改变notch协同因子或效应因子的表达/功能。5.一种预防和/或治疗动脉粥样硬化药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括人参皂苷f5。6.人参皂苷f5在制备rbpj蛋白抑制剂中的应用。7.一种rbpj蛋白抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的活性成分包括人参皂苷f5。8.权利要求7所述的rbpj蛋白抑制剂在制备预防和/或治疗notch信号通路异常激活的疾病的产品中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述notch信号通路异常激活的疾病包括动脉粥样硬化药物。10.一种notch信号通路抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的活性成分包括人参皂苷f5。

技术总结
本发明提供了人参皂苷F5在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用，属于生物技术和医药技术领域；本发明研究发现人参皂苷F5能够用于制备Notch信号通路抑制剂，所述人参皂苷F5能够抑制Notch通路关键转录因子RBPJ蛋白、改变Notch协同因子或效应因子的表达/功能，从而抑制下游基因的表达，进而实现抑制AS的发展进展、减少动脉粥样硬化斑块生成的目的；所述人参皂苷F5在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中具有很好的应用前景。粥样硬化药物中具有很好的应用前景。粥样硬化药物中具有很好的应用前景。


技术研发人员：芮蒙杰 米珂 高良来 冯春来
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/7/22