一种灰肉色链霉菌0728-09及其应用的制作方法

1.本发明涉及环境治理微生物领域，具体涉及一种灰肉色链霉菌0728-09及其应用。


背景技术：

2.随着全球水体富营养化程度的加剧，有害藻类水华的暴发频率越来越高，且影响范围变大，其对环境和经济造成很大影响，其中，球形棕囊藻也是引起水华的一种主要藻类。该藻球形群体外围具有一层柔软的胶质被且藻体含多糖，当大量繁殖形成赤潮时，含胶质和糖的藻体便紧紧贴在鱼鳃上。影响鱼的呼吸和摄食，致使鱼类窒息，缺氧而死亡。其次，该藻巨大的生物量(尤其是黎明和傍晚时)可造成水体缺氧导致灾害。再加上藻体和藻细胞死亡腐烂后会产生溶血毒素等有毒物质，对水体环境的破坏将持续一定时间，严重时会导致鱼类大面积死亡，尤其对网箱养殖和对虾育苗危害更大。
3.目前，许多方法被用于防治藻类水华，诸如排水改道、曝气循环、化学抑藻、生物去除等方法。排水改道、曝气循环处理等方法成本高，化学抑藻容易造成二次污染，而生物方法除藻是利用藻类的天敌及其代谢产生的物质对藻类的生长、繁殖进行抑制，从而达到抑制藻类数量、改善水体质量的方法，其中通过抑藻真菌来抑藻是目前的研究热点之一。该方法一般从暴发水华的水体中分离、富集抑藻真菌，其优势是安全、环保。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种灰色链霉菌0728-09及其应用。
5.本发明第一目的在于提供一种自主筛选的具有高抑藻活性的灰色链霉菌0728-09，分类命名为灰肉色链霉菌streptomycesgriseoincarnatus，该菌株已于2022年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25117，保藏地址：中国北京。
6.本发明所述的灰肉色链霉菌0728-09是从防城港海水中分离纯化获得的原始菌株，所述灰肉色链霉菌0728-09的筛选方法包括以下步骤：
7.(1)取防城港区域海水，采用无菌水对海水进行梯度稀释：101、102、103、104、105、106，每个梯度稀释液取0.1ml涂布在固体培养基上，30℃培养5-7天。
8.(2)挑取不同菌落，划线于固体培养基上，置于30℃培养3-5天。观察分离菌落是否纯化。若有杂菌，重复该步骤直至纯培养。
9.(3)将上述纯化后的菌株接种于液体培养基中，50-100rpm，30℃振荡培养3-5天。
10.(4)取1ml上述菌液接种于20ml指数生长的无菌球形棕囊藻培养液中，于20
±
1℃，12h光照,12h黑暗，2400lux光照强度条件下，培养2天，液体培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行，检测叶绿素a含量，判断藻细胞的数量，从而筛选出有抑藻活性最强菌株为灰肉色链霉菌0728-09。
11.根据本发明实施方案，所述固体培养基组分包括：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化
水1000ml。
12.根据本发明实施方案，所述液体培养基组分包括：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml。
13.本发明的第二目的在于提供一种灰肉色链霉菌0728-09在球形棕囊藻治理中的应用。具体是将灰肉色链霉菌0728-09进行发酵培养得到灰肉色链霉菌菌液，并将所述菌液应用于球形棕囊藻治理。
14.本发明第三目的在于提供一种灰肉色链霉菌0728-09培养及菌液制备的方法，包括以下步骤：
15.将灰肉色链霉菌接入固体斜面培养基中进行活化，培养温度为30-37℃，静置培养2-4d；活化后的固体平板菌株接入一级种子培养基中，进行一级种子扩大培养，培养温度为30-37℃，转速100-200rpm，培养3-7d；按1-5％的接种量将一级种子液接入发酵培养基进行扩大培养，培养温度为30-37℃，转速50-100rpm，培养3-7d，收集菌液备用。
16.上述培养基中包含碳源，该碳源包括葡萄糖、可溶性淀粉、玉米浆粉、糖蜜、甘油和葡萄糖浆中的至少一种；培养基中还包含氮源，该氮源包括硝酸钾、硫酸铵、大豆粉、酵母提取物、蛋白胨、硝酸钾、谷氨酸钠、氨水中的至少一种；
17.上培养基中还包括无机盐，该无机盐包括硫酸镁、氯化钾、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁中的至少一种。
18.根据本发明实施方案，优选的，所述固体平板培养基中的组分包括：可溶性淀粉1-3％(w/v)、琼脂粉1-2％(w/v)、硝酸钾0.05-0.2％(w/v)、磷酸氢二钾0.025-0.075％(w/v)、硫酸镁0.025-0.075％(w/v)、氯化钠0.025-0.075％(w/v)、硫酸亚铁0.0005-0.0015％(w/v)。
19.根据本发明实施方案，优选的，所述中一级种子培养基中的组分包括：溶性淀粉1-3％(w/v)、硝酸钾0.05-0.2％(w/v)、磷酸氢二钾0.025-0.075％(w/v)、硫酸镁0.025-0.075％(w/v)、氯化钠0.025-0.075％(w/v)、硫酸亚铁0.0005-0.0015％(w/v)。
20.根据本发明实施方案，优选的，所述发酵培养基中的组分包括：可溶性淀粉1-3％(w/v)、硝酸钾0.05-0.2％(w/v)、磷酸氢二钾0.025-0.01％(w/v)、硫酸镁0.025-0.075％(w/v)、氯化钠0.025-0.075％(w/v)、硫酸亚铁0.0005-0.003％(w/v)。
21.更进一步地，根据本发明实施方案，所述固体平板培养基中的组分包括：可溶性淀粉2％(w/v)、琼脂粉1.5％(w/v)、硝酸钾0.1％(w/v)、磷酸氢二钾0.05％(w/v)、硫酸镁0.05％(w/v)、氯化钠0.05％(w/v)、硫酸亚铁0.001％(w/v)。
22.更进一步地，根据本发明实施方案，所述一级种子培养基中的组分包括：可溶性淀粉1.5％(w/v)、硝酸钾0.1％(w/v)、磷酸氢二钾0.05％(w/v)、硫酸镁0.05％(w/v)、氯化钠0.05％(w/v)、硫酸亚铁0.001％(w/v)；
23.更进一步地，根据本发明实施方案，所述发酵培养基中的组分包括：可溶性淀粉2％(w/v)、硝酸钾0.1％(w/v)、磷酸氢二钾0.06％(w/v)、硫酸镁0.05％(w/v)、氯化钠0.05％(w/v)、硫酸亚铁0.0012％(w/v)。
24.本发明还提供上述灰肉色链霉菌0728-09在球形棕囊藻治理方法，包括以下步骤：取1ml菌液加入20ml球形棕囊藻的培养液中，培养2天，取样品检测其抑藻效果。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
26.本发明的灰肉色链霉菌0728-09作为一种基本菌株，原料易得，成本低廉；作为“抑藻剂”，采用天然生物材料，环境亲和性强，使用中无二次污染，操作简便，可实施性强，抑制效果良好，筛选出的灰肉色链霉菌0728-09抑藻率可达88％；发酵培养基成分经优化后，可溶性淀粉含量为2％，硫酸亚铁含量为0.0012％，磷酸氢二钾含量为0.06％。随后进行逐级放大发酵培养，从而获得大量发酵液，通过对发酵液进行测试，发现抑藻率仍可为74％，具有较高的抑藻效率。灰肉色链霉菌0728-09大规模的发酵后抑藻效果未大幅度下降，有利于实际应用，为利用生物方法处理水体藻华问题提供新的方法和方向。
附图说明
27.图1为本发明多株灰肉色链霉菌菌株抑藻效率对比图。
28.图2为本发明灰肉色链霉菌种在固体培养基上的形态。
29.图3为本发明灰肉色链霉菌0728-09生长曲线。
30.图4为不同生长阶段灰肉色链霉菌株对球形棕囊藻抑制作用。
31.图5为灰肉色链霉菌0728-09发酵液对球形棕囊藻抑制作用。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
33.实施例1：
34.1、菌株的筛选
35.(1)取防城港区域的海水样品10ml，溶解于湿热灭菌后的90ml无菌水中，混匀。采用无菌水对海水进行梯度稀释：101、102、103、104、105、106，每个梯度稀释液取0.1ml涂布在固体培养基上(培养基配方：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml)，30℃培养5-7天。
36.(2)挑取不同菌落，划线于固体培养基上(培养基配方：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml)，置于30℃培养3-5天。观察分离菌落是否纯化。若有杂菌，重复该步骤直至纯培养。
37.(3)将上述纯化后的菌株接种于液体培养基中(硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml)，50-100rpm，30℃振荡培养3-5天。
38.(4)取1ml上述菌液接种于20ml指数生长的球形棕囊藻培养液中，于20
±
1℃，12h光照，12h黑暗，2400lux光照强度条件下，培养2天，液体培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行，检测叶绿素a含量，判断藻细胞的数量，从而筛选出抑藻活性的最高的菌株为灰肉色链霉菌(菌株编号0728-09)，如图1。多株菌株通过抑制藻测试，结果显示，菌株0728-06、0728-07、0728-08、0728-09、0728-10中0728-09菌株抑藻效率最高，达到88％。此菌株为高效抑藻菌株，对该菌株进行鉴定。
39.2、菌种的鉴定
40.取上述抑藻效果最高的菌株灰肉色链霉菌0728-09，菌种在高氏一号培养基上，30℃培养3天，进行菌种鉴定，鉴定结果如下：孢子丝直，柔曲，钩状、松敞螺旋形；孢子柱形、椭圆；菌落呈白色，见图2。由中国科学院微生物研究所进行测序，菌种16s rrna基因序列测定结果如seq id no:1所示；根据菌种的培养特征、显微特征、16srrna基因序列等实验数据综合分析，菌株的鉴定结果为：streptomyces griseoincarnatus灰肉色链霉菌。
41.所述灰肉色链霉菌0728-09的16srrna基因序列如下(seq id no:1)：tgcagtcgaacgatgaacctccttcgggaggggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggatactgacccgcttggcatccaagcggttcgaaagctccggcggtgcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcgagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggttgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcagtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggcactaggtgtgggcgacattccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacggggcccgcacaagcggcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaagcttgacatacaccggaaagcatcagagatggtccccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcccgtgttgccagcaggcccttgtggtgctggggactcacgggagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaat gagctgcgataccgcgaggtggagcgaatctaaaagcggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaaccccttgtgggagggagcttcg
42.实施例2
43.灰肉色链霉菌0728-09生长曲线绘制及不同生长阶段抑藻测试
44.(1)将灰肉色链霉菌0728-09接种于新鲜的固体培养基上(培养基配方：硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，琼脂：15.0g，纯化水1000ml)划线分离，于30℃培养3-5天；
45.(2)挑取平板上的单菌落接种于液体培养基中(硝酸钾：1.0g，磷酸氢二钾：0.5g，硫酸镁：0.5g，氯化钠：0.5g，硫酸亚铁：0.01g，可溶性淀粉：20.0g，纯化水1000ml)，50-100rpm，30℃振荡培养3-5天。
46.(3)菌株在摇瓶培养基中培养，不同时间段取样检测菌体湿重，并绘制生长曲线。如图3。接种后，进行菌株培养，培养时间36小时以内为延迟期；培养时间为36小时至72h为指数期；培养时间72小时至144h为平台期。
47.(4)不同生长阶段对球形棕囊藻抑制作用：依据菌株的生长曲线，选取延迟期，指数期及平台期的菌液作为测试组，培养基为对照组。
48.(5)取1ml菌液或培养基加入20ml藻培养液中，培养48h，取样测试抑藻效率。
49.如图4所示，实验结果表明，菌株处于指数期，抑藻效果最明显，可能是菌株在此阶段生长迅速，抑藻活性较高。
50.实施例3
51.菌株发酵培养基成分的优化
52.为了提高菌种发酵后的抑藻活性，对发酵培养基不同组分含量进行优化。将灰肉色链霉菌0728-09接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为30℃，静置培养3d。活化后的固体平板菌株接入1l摇瓶中进行发酵培养，装液量为400ml，培养温度为30℃，转速100rpm，培养3d，得到发酵液。
53.其中培养基组成比例分别为：固体平板培养基(w/v)中的组分包括：可溶性淀粉2％、琼脂粉1.5％、硝酸钾0.1％、磷酸氢二钾0.05％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.05％、硫酸亚铁0.001％；
54.发酵培养基(w/v)中的组分包括：硝酸钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.05％；可溶性淀粉含量分别为1％、1.5％、2％，磷酸氢二钾含量分别为0.03％、0.06％、0.09％，硫酸亚铁0.0006％、0.0012％及0.0024％，试验结果见表1。
55.表1发酵培养基优化正交结果
[0056][0057]
极差分析显示，可溶性淀粉含量优于硫酸亚铁含量，硫酸亚铁含量优于磷酸氢二钾含量。经直接分析可得，最优发酵培养基成分为可溶性淀粉含量为2％，硫酸亚铁含量为0.0012％，磷酸氢二钾含量为0.09％。
[0058]
实施例4：灰肉色链霉菌0728-09发酵液抑藻应用
[0059]
(1)将灰肉色链霉菌0728-09接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为30℃，静置培养3d。其中培养基组成比例分别为：固体平板培养基(w/v)中的组分包括：可溶性淀粉2％、琼脂粉1.5％、硝酸钾0.1％、磷酸氢二钾0.05％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.05％、硫酸亚铁0.001％；
[0060]
(2)活化后的固体平板菌株接入1l摇瓶中进行发酵培养，装液量为400ml，培养温度为30℃，转速100rpm，培养3d，得到发酵液。发酵培养基(w/v)中的组分包括：硝酸钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.05％可溶性淀粉含量为2％，硫酸亚铁含量为0.0012％，磷酸氢二钾含量为0.09％
[0061]
(3)制备的灰肉色链霉菌0728-09发酵液，取1ml菌液或培养基加入20ml球形棕囊藻的培养液中，于20
±
1℃，12h光照，12h黑暗，2400lux光照强度条件下，培养2天，取样测试抑藻效率。如图5所示，灰肉色链霉菌0728-09菌株先经菌种活化，随后进行进一步的放大发酵培养，得到发酵液。随后采用菌液：藻液(1:20)比例投放测试，2天后灰肉色链霉菌0728-09的菌液抑藻效率可达到74％。经过放大培养后的菌液，抑藻效率较初筛时未明显下降，有利于后期大规模培养及应用。

技术特征：
0.075%、硫酸亚铁0.0005-0.003%；优选为可溶性淀粉2%、硝酸钾0.1%、磷酸氢二钾0.06%、硫酸镁0.05%、氯化钠0.05%、硫酸亚铁0.0012%。

技术总结
本发明提供一种高效抑藻活性的灰肉色链霉菌0728-09及其应用，所述的灰肉色链霉菌0728-09由防城港海水中分离纯化获得原始菌株。经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定，分类命名为灰肉色链霉菌，保藏编号为CGMCC No.25117。本发明的灰肉色链霉菌0728-09经优化后的培养基发酵培养后获得大量具有抑藻活性的菌液。本发明的灰肉色链霉菌0728-09是高效抑藻微生物，具有较大的应用价值。具有较大的应用价值。具有较大的应用价值。


技术研发人员：王辉 裴嘉祺 汪辉
受保护的技术使用者：南京灿辰微生物科技有限公司
技术研发日：2022.11.30
技术公布日：2023/7/31