以衣康酸为起点抑制Tet靶点蛋白的药物开发

以衣康酸为起点抑制tet靶点蛋白的药物开发
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及衣康酸及其衍生物用于制备治疗tet酶相关疾病的药物的应用。


背景技术：

2.细胞因子风暴综合征(也称细胞因子释放综合征)是一种常见的、由病毒等病原菌感染引起的全身炎症反应，其特点是众多细胞产生和释放大量的促炎细胞因子。这种失控的炎症反应可导致感染性休克、多器官损伤，甚至最终导致器官衰竭。重症新冠肺炎及其导致的死亡为典型细胞因子风暴综合征。
3.在病毒和细菌等病原菌感染，除了采用抗生素等抑制感染源，消除过度炎症反应包括细胞因子风暴导致疾病所引发的组织损伤也是治疗的重要组成部分。目前常见的抗炎药物分为甾体和非甾体。其中，甾体通常是一类激素类药物(如肾上腺皮激素)，抗炎作用强，但存在水钠潴留、变虚胖、骨质疏松等副作用。非甾体类抗炎作用弱，副作用主要是胃肠道反应，还有心血管疾病的风险。因此，亟需开发更安全有效的抗炎药物。
4.表观遗传酶tet家族共有三个成员(tet1/2/3)，参与dna主动去甲基化过程，与基因转录调控密切相关。以往研究表明，在细菌、病毒、真菌等病原菌感染时，宿主巨噬细胞的基因组dna发生去甲基化，激活nf-κb及干扰素通路等炎症相关基因表达和机体免疫应答。tet2在此过程中起到一定作用。
5.tet蛋白依赖α-酮戊二酸作为辅因子，此前发现的能够抑制tet酶活的代谢物小分子多为α-酮戊二酸的类似物。它们通过竞争性结合tet蛋白的活性中心来抑制其酶活，例如羟基戊二酸、琥珀酸、延胡索酸等。但上述代谢物分子对α-酮戊二酸依赖的众多酶活性都会有影响，存在靶点不专一、对tet酶选择性不高等问题。上述代谢物分子在病原菌感染巨噬细胞时积累缓慢或根本不发生积累。特异性tet抑制剂的研发目前尚属空白。
6.因此，本领域有需要提供一种能够治疗tet酶相关疾病，尤其是细胞因子风暴综合征，但对其他α-酮戊二酸依赖的酶活性无影响的药物。


技术实现要素：

7.本发明的目的就是提供一种能够治疗tet酶相关疾病，但对其他α-酮戊二酸依赖的酶活性无影响的药物。
8.在本发明的第一方面，提供了一种制剂组合，所述制剂组合包括：
9.(a)药物组合物，其含有衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂作为活性成分；
10.(b)检测tet酶的试剂。
11.在另一优选例中，所述的衣康酸衍生物为化学修饰的衣康酸，优选地为辛基修饰的衣康酸。
12.在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：衣康酸代谢前体、代谢产生衣康酸所需
的酶、针对衣康酸或前体生成的代谢酶激活剂、上调代谢产生衣康酸所需的酶的基因或mrna或蛋白表达水平的启动子元件和/或表达载体中的任意一种或多种。
13.在另一优选例中，所述的衣康酸代谢前体为顺乌头酸。
14.在另一优选例中，所述的代谢产生衣康酸所需的酶为顺乌头酸脱羧酶irg1。
15.在另一优选例中，所述的tet酶包括：tet1、tet2、tet3、或其组合。
16.在另一优选例中，所述的tet酶包括：tet2、tet3、或其组合。
17.在另一优选例中，所述的检测tet酶的试剂包括：检测tet酶含量的试剂、检测tet酶活性的试剂、检测编码tet酶的基因表达水平的试剂、或其组合。
18.在另一优选例中，所述的检测tet酶的试剂为检测tet酶活性的试剂。
19.在另一优选例中，所述检测tet酶含量指检测细胞中的tet酶含量。
20.在另一优选例中，所述的细胞包括巨噬细胞、单核细胞。
21.在另一优选例中，所述的细胞指外周血单核细胞。
22.在另一优选例中，所述检测tet酶活性指检测tet酶催化产物的含量。
23.在另一优选例中，所述检测tet酶活性指检测dna的5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)含量。
24.在另一优选例中，所述的检测tet酶活性包括检测体外tet酶活以及检测细胞组织内的tet酶活性。
25.在另一优选例中，所述活性成分占药物总重量的百分含量为0.1-99％。
26.在另一优选例中，所述的tet酶为tet2，并且所述的药物组合物还包含其他预防和/或治疗细胞因子风暴相关疾病的药物。
27.在另一优选例中，所述的抗炎成分包括：甾体类抗炎药(如氢化可的松、强的松、泼尼松、地塞米松)、非甾体类抗炎药(如阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布)、或其组合。
28.在另一优选例中，所述的药物组合物的制剂形式为口服制剂或非口服制剂。
29.在另一优选例中，所述的药物组合物选自下组：注射剂、吸入剂、酊剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、片剂、丸剂、悬浮剂、乳剂、含片、或滴丸。
30.在另一优选例中，所述药物组合物的给药方式为口服或注射。
31.在另一优选例中，所述药物组合物的给药方式为静脉注射或腹腔内注射。
32.在另一优选例中，所述的药物组合物还包括其他预防和/或治疗细胞因子风暴相关疾病的药物。
33.在另一优选例中，所述药物组合物施用的对象为人或非人哺乳动物(如啮齿类动物)。
34.在另一优选例中，所述的制剂组合用于实施预防和/或治疗tet酶增多或tet酶活性上调相关疾病的方法。
35.在另一优选例中，所述的预防和/或治疗tet酶增多或tet酶活性上调相关疾病的方法包括下述步骤；
36.(i)从受试对象中获得待测样品；
37.(ii)利用所述检测tet酶的试剂(b)，检测待测样品中tet酶的含量或tet酶的活性；
38.(iii)如检测到待测样品为tet酶阳性，则给受试对象施用所述药物组合物(a)，以
预防和/或治疗tet酶增多或tet酶活性上调相关疾病。
39.在另一优选例中，所述的tet酶阳性包括：tet酶含量增多、tet酶活性上升、编码tet酶的基因表达水平上升。
40.在另一优选例中，所述的tet酶增多指，tet酶含量(e1)与其生理情况下含量(e0)之比(即e1/e0)≥1.2，优选地≥1.5，更优选地≥2.0
41.在另一优选例中，所述的tet酶含量指单核细胞、或巨噬细胞中的tet酶含量。
42.在另一优选例中，所述的tet酶含量指外周血单核细胞中的tet酶含量。
43.在另一优选例中，所述的tet酶活性升高指，tet酶催化产物生成水平(l1)与其生理情况下催化产物生成水平水平(l0)之比(即l1/l0)≥1.2，优选地≥1.5，更优选地≥2.0。
44.在另一优选例中，所述的tet酶催化产物包括5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。在另一优选例中，所述的tet酶为tet1，并且所述的疾病为受精卵及胚胎发育异常相关疾病。
45.在另一优选例中，所述的tet酶为tet2，并且所述的疾病为细胞因子风暴相关疾病。
46.在另一优选例中，所述的细胞因子风暴相关疾病指细胞因子短期内异常增多导致器官机能下降的疾病。
47.在另一优选例中，所述的细胞因子包括nf-κb以及jak-stat信号通路调控的细胞因子以及趋化因子。
48.在另一优选例中，所述的细胞因子包括但不限于：il1β、il6、il12、ifnα、ifnβ、ifnγ、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl5。
49.在另一优选例中，所述的细胞因子风暴相关疾病包括：细菌或病毒等感染性疾病、自身免疫性疾病、或其组合。
50.在另一优选例中，所述的感染性疾病包括细菌感染和病毒感染。
51.在另一优选例中，所述的感染性疾病包括：内毒素血症、急性肺炎、急性肝炎、急性脑膜炎、急性角膜炎、或其组合。
52.在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病包括：多发性硬化。
53.在另一优选例中，所述的tet酶为tet3，并且所述的疾病为神经系统疾病。
54.在本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的制剂组合的用途，用于制备治疗tet酶增多或活性上调相关疾病的试剂盒。
55.在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述检测tet酶的试剂和所述药物组合物是各自独立包装的。
56.在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签和/或说明书，所述的说明书注明所述试剂盒用于治疗tet酶增多或活性上调相关疾病。
57.在本发明的第三方面，提供了一种衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂的用途，用于制备治疗tet酶相关疾病的制剂或药物组合物。
58.在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性的抑制tet酶活性的方法，包括步骤：
59.将tet酶与衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂解除，从而抑制所述tet酶的活性。
60.在另一优选例中，所述的tet酶为游离的tet酶、或细胞内的tet酶。
61.在另一优选例中，所述的细胞为单核细胞、或巨噬细胞。
62.在本发明的第五方面，提供了一种治疗和/或预防tet酶相关疾病的方法，包括步骤：
63.给有需要的对象施用治疗有效量的衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂，从而治疗和/或预防tet酶相关疾病。
64.在另一优选例中，所述的方法包括下述步骤：
65.(i)从受试对象中获得待测样品；
66.(ii)利用所述检测tet酶的试剂(b)，检测待测样品中tet酶的含量或tet酶的活性；
67.(iii)如检测到待测样品中存在tet酶增多或tet酶活性升高，则给受试对象施用所述药物组合物(a)，从而治疗和/或预防tet酶相关疾病。
68.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
69.下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
70.图1显示了衣康酸特异性抑制tet2的实验结果。
71.图1a显示了基于固定底物dna和5hmc荧光检测的体外酶活性体系检测tet的体外酶活流程图。
72.图1b显示了衣康酸以及图示代谢物体外对tet2酶活影响的测定。
73.图1c显示了通过lc-ms确定了衣康酸及oi抑制巨噬细胞的基因组5hmc水平。
74.图1d显示了lps刺激巨噬细胞产生高水平衣康酸。
75.图1e显示了衣康酸积累导致tet2活性被抑制。
76.图1f显示了衣康酸积累导致不影响α-酮戊二酸依赖的其他酶，如组蛋白去甲基化酶kdm。
77.图2显示了衣康酸抑制tet2和阻止nf-κb及干扰素通路等炎症相关基因表达的实验结果。
78.图2a显示了巨噬细胞中被lps诱导表达基因中，约72％的基因被衣康酸或tet2基因剔除所抑制。
79.图2b显示了nf-κb及干扰素通路等炎症相关基因被tet2诱导表达上调，可被衣康酸介导tet2活性抑制而显著下调。
80.图3显示了衣康酸通过抑制tet2保护小鼠抵抗内毒素血症。
81.图3a显示了腹腔注射衣康酸和lps诱导内毒素血症的小鼠模型示意图。
82.图3b显示了衣康酸减弱了lps诱导的tet2野生型嵌合小鼠中促炎细胞因子和趋化因子的增加，但不会减弱tet2
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嵌合小鼠中促炎细胞因子和趋化因子的增加。
83.图3c显示了衣康酸可减轻tet2野生型嵌合小鼠中lps诱导的肝损伤，但不能减轻tet2
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嵌合小鼠的肝损伤。
84.图3d、图3e、图3f显示了衣康酸可减轻tet2野生型嵌合小鼠lps诱导的肺水肿和肺损伤，但不能减轻tet2
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嵌合小鼠的肺水肿和肺损伤。图3d为小鼠肺组织湿/干重量比，图3e为he染色、图3f为肺损伤临床打分。
85.图3g为kaplan-meier存活曲线，显示了衣康酸保护tet2野生型嵌合小鼠lps诱导的致死率，但不保护tet2
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嵌合小鼠。
86.图4显示了衣康酸体外对tet3酶活影响的测定。
87.显示值为三次重复试验的平均值和s.d.。p值使用t-test检验或双向方差分析为多重比较。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001，n.s.表示不显著。
具体实施方式
88.本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了衣康酸在制备tet酶相关疾病，尤其是治疗细胞因子风暴相关疾病的药物中的用途。具体地，本发明人采用未经修饰、天然存在、安全有效的衣康酸，证实腹腔注射该代谢物小分子，能使小鼠抵抗lps诱导的内毒素血症，具体表现为降低细胞因子水平，缓解肺水肿和肝损伤，并延长小鼠生存期。在此基础上，完成了本发明。
89.在本发明中，通过体外酶活、核磁共振分析、细胞实验和动物体内实验，证实了衣康酸是首个tet家族酶特异性抑制剂，尤其是特异性抑制tet2，其仅对tet酶活性产生抑制作用，而对与tet酶同样依赖α-酮戊二酸激活的其他多种酶则无抑制。因此本发明的方法能够在治疗细胞因子风暴的同时，避免对其他正常的酶功能产生干扰。
90.同时，本发明明确了tet酶是介导衣康酸抗炎作用的主要功能性蛋白靶标。本发明的体内实验证明了，衣康酸在用于治疗tet2
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(即tet2酶催化失活)的小鼠炎症反应时，并不能引起炎症指标的显著下降。但其对野生型(tet2+/+)小鼠却有着显著的炎症抑制效应。据此，本发明提供了检测tet2活性的试剂与衣康酸的联合应用，以便实现对炎症的精准治疗。
91.因此，本发明针对tet靶向蛋白，利用一种安全的天然代谢物分子，即衣康酸为抑制剂药效团起点，开发了tet2酶活特异性抑制剂，阻止nf-κb及干扰素通路等炎症相关基因表达和机体免疫应答，作为安全有效治疗过度炎症反应包括细胞因子风暴导致疾病的原创型药物。
92.术语
93.如本文所用，术语“本发明的药物组合物”、“本发明的药物”可互相替换使用，均指本发明第一方面中限定的含有衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂作为活性成分的制剂或药物组合物。
94.如本文所用，术语“检测试剂”、“本发明的检测试剂”、“tet酶检测试剂”、“本发明的tet酶检测试剂”可互换使用，均指本发明第一方面中限定的检测tet酶的试剂。
95.如本文所用，术语“制剂组合”、“药物和检测试剂组合”、“本发明的制剂组合”、“本发明的药物和检测试剂组合”可互换使用，均指本发明第一方面所述的制剂组合。
96.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
97.如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。
98.衣康酸
99.衣康酸学名为甲叉琥珀酸，亚甲基丁二酸，是不饱和二元有机酸，分子式为c5h6o4，如下式1所示：
[0100][0101]
衣康酸在体内由顺乌头酸(aconitate)脱羧代谢而来。免疫应答基因1(immune-responsive gene 1,irg1)在lps激活的巨噬细胞中转录上调，该基因编码蛋白是顺乌头酸脱羧酶(aconitate decarboxylase 1，acod1)，其代谢产物即为衣康酸(itaconic acid,ita)。
[0102]
在静息状态巨噬细胞中，irg1不表达，衣康酸几乎无法被检测到；在病原体感染和炎症反应过程中，irg1在巨噬细胞等免疫细胞中迅速被诱导表达，并在感染后几个小时内使得衣康酸在胞内浓度高达数毫摩尔。衣康酸的化学修饰衍生物，如4-辛烷基-衣康酸，可作为抗炎和延缓内毒素血症小鼠的生存周期。
[0103]
本发明发现，衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂能够抑制tet酶的活性，并且对除tet酶以外的α-酮戊二酸依赖性酶活性无影响，具有良好的安全性。
[0104]
tet酶
[0105]
表观遗传酶tet家族共有三个成员(tet1/2/3)，参与dna主动去甲基化过程，与基因转录调控密切相关。以往研究表明，在细菌、病毒、真菌等病原菌感染时，宿主巨噬细胞的基因组dna发生去甲基化，激活nf-κb及干扰素通路等炎症相关基因表达和机体免疫应答。
[0106]
tet家族的所有tet蛋白(tet1/2/3)都含有催化功能的碳端结构域，属于cupin-样双加氧酶超家族，并表现出α-酮戊二酸(α-kg)和二价铁离子依赖性双加氧酶活性。tet蛋白通过这些结构域将5mc氧化成5hmc，并且需要α酮戊二酸作为酶活性的共底物。
[0107]
研究证明dna去甲基化酶tet2功能缺失在细胞中及动物体内具有抗炎作用，并找到了靶向tet2的抑制剂：衣康酸。这为以tet2为靶点酶，衣康酸为抑制剂药效团起点，开发全新抗炎药物治疗过度炎症反应(包括细胞因子风暴综合征)，提供了依据和基础。
[0108]
本发明优选的靶向细胞为巨噬细胞等炎症细胞。tet2敲除在巨噬细胞中导致5hmc下降约90％，并且在tet2缺失的巨噬细胞中，衣康酸无法进一步降低5hmc含量。此外，tet2失活突变小鼠经lps诱导的内毒素血症表型，与加衣康酸处理的小鼠完全一致。衣康酸处理对tet2失活突变小鼠不再发挥抗炎的保护作用(图3)。上述结果说明在细胞或小鼠体内，衣康酸抗炎的主要功能靶点是tet2。
[0109]
在本发明中，本发明人利用tet2基因敲除小鼠和体外培养的巨噬细胞，发现tet2是巨噬细胞里最主要的dna去甲基化酶(占比90％)。本发明人还发现通过tet2基因突变或
tet酶活抑制，能够显著缓解lps诱导的小鼠内毒素血症，降低血浆细胞因子水平，缓解肺水肿和肝损伤，并延长小鼠生存周期。因此，衣康酸作为tet2抑制剂将有助于在病原菌感染时避免机体的过度免疫反应和引起的组织损伤。
[0110]
在衣康酸与α-酮戊二酸竞争性结合tet2蛋白酶的检测中，通过核磁共振(nmr)证明衣康酸与α-酮戊二酸同样地结合tet2。体外和细胞水平的实验中，同样验证了衣康酸抑制tet2酶活的能力，其中体外实验中衣康酸抑制tet2酶活的ic50为171μm；细胞实验结果中衣康酸能够抑制巨噬细胞中tet(主要为tet2)酶活性，抑制程度高达90％。
[0111]
本发明还验证了衣康酸对tet3酶的结合和中和活性。tet家族酶(即tet1、tet2和tet3)具有相同的活性中心，均依赖与α-酮戊二酸结合产生酶活性，而本发明的衣康酸药物正是通过与α-酮戊二酸竞争性结合，抑制酶活性而发挥作用。因此，本发明能够起到抑制tet家族酶的效果。
[0112]
需指出，制备本发明的药物组合物或本发明的制剂组合时，最优选使用衣康酸或其衍生物(如辛基衣康酸)，这是因为衣康酸及其衍生物对除tet酶以外的α-酮戊二酸依赖性酶活性无影响，具有良好的安全性。但是，α-酮戊二酸的类似物，例如羟基戊二酸、琥珀酸、延胡索酸等也能够被用于制备本发明的制剂组合。本领域技术人员能够根据实际情况进行选择。
[0113]
细胞因子与细胞因子风暴
[0114]
如本文所用，术语“细胞因子(cytokine，ck)”是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子主要由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、t细胞、b细胞、nk细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)产生。
[0115]
如本文所用，术语“细胞因子风暴(cytokine storm)”是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子，如tnf-α、il-1、il-6、il-12、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、mcp-1和il-8等，迅速大量产生的现象，是引起急性呼吸窘迫综合征和多脏器衰竭的重要原因。免疫系统的日常工作是清除感染，但若免疫系统被激活到极限程度或者失去控制，极端免疫攻击就是“细胞因子风暴”。免疫细胞通过细胞因子彼此沟通，细胞因子是细胞释放到血液中的小分子，可以令免疫细胞冲到感染部位、吞噬遭到损伤的细胞，甚至穿透血管壁。细胞因子还可以引发炎症，令被破坏的机体肿胀、发热以及疼痛。细胞因子风暴还会引发一氧化氮的大量释放。这些综合因素能够使血压降低至危险水平，造成严重患者死于严重感染性休克。
[0116]
本发明的药物组合物通过抑制tet2酶的活性，能够有效地抑制细胞因子风暴，本发明的药物组合物能够抑制的细胞因子包括fkb以及jak-stat信号通路调控的细胞因子以及趋化因子。具体地，本发明的药物组合物能够抑制的细胞因子包括但不限于：il1β、il6、il12、ifnα、ifnβ、ifnγ、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl5。
[0117]
药物组合物
[0118]
本发明所提供的药物组合物优选含有重量比为0.1-99wt％的第一活性成份，其余部分为第二活性成分、药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。
[0119]
本发明的第一活性成分可以直接应用与治疗或预防癌症转移。此外，也可以与其
他治疗剂，即第二活性成分联用。
[0120]
所述的第二活性成分可以是任何能够预防和/或治疗癌症或癌症转移的药物成分，包括但不限于化疗剂、内分泌治疗剂、靶向治疗剂等。
[0121]
需要的时候，在本发明药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0122]
本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、注射剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。
[0123]
本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制剂配方的单位计量中通常包含0.05-1000mg本发明的活性化合物，优选地，制剂配方的单位计量中包含1mg-500mg本发明的活性化合物。
[0124]
本发明的药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最优选日剂量为0.01-400mg/kg体重，一次性服用，或0.01-200mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
[0125]
本发明的药物或抑制剂可通过各种不同方式施用，例如可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹导入机体。
[0126]
典型地，本发明活性成分或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
[0127]
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
[0128]
本发明活性成分可以被制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
[0129]
为了将本发明活性成分被制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
[0130]
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
[0131]
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明活性成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明的胶囊剂。
[0132]
为将本发明活性成分制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、ph调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；ph调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
[0133]
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。
[0134]
本发明的活性成分或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。
[0135]
当本发明的活性成分与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
[0136]
制剂组合和试剂盒
[0137]
本发明提供了一种制剂组合，其包括：
[0138]
(a)药物组合物，其含有衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂作为活性成分；
[0139]
(b)检测tet酶的试剂。
[0140]
本发明的制剂组合可用于特异性地治疗tet酶升高的疾病。
[0141]
具体地，本发明可以包含检测tet1酶的试剂，并适用于检测和治疗tet1酶阳性的疾病，优选为受精卵发育异常相关疾病。
[0142]
或者，本发明可以包含检测tet3酶的试剂，并适用于检测和治疗tet3酶阳性的疾病，优选为神经系统疾病。
[0143]
在优选的实施方式中，本发明可以包含检测tet2酶的试剂，并适用于检测和治疗tet2酶阳性的疾病，优选为细胞因子风暴相关疾病。
[0144]
或者，本发明也可以包含检测上述任意两种或以上酶的试剂的组合。本发明也可适用于具有上述任意两种或两种以上疾病伴随发病的情况。
[0145]
本发明的制剂组合，或使用该制剂组合制备的试剂盒，可用于实施预防和/或治疗tet酶增多或tet酶活性上调相关疾病的方法。该方法主要包括下述步骤：
[0146]
(i)从受试对象中获得待测样品；
[0147]
(ii)利用所述检测tet酶的试剂(b)，检测待测样品中tet酶的含量或tet酶的活性；
[0148]
(iii)如检测到待测样品为tet酶阳性，则给受试对象施用所述药物组合物(a)，以预防和/或治疗tet酶增多或tet酶活性上调相关疾病。
[0149]
所述的tet酶阳性包括但不限于：tet酶含量增多、tet酶活性上升、编码tet酶的基
因表达水平上升。
[0150]
本发明的检测tet酶的试剂包括但不限于：检测tet酶含量的试剂、检测tet酶活性的试剂、检测编码tet酶的基因表达水平的试剂、或其组合。本领域技术人员能够根据该检测目标选择相应检测方法。
[0151]
本发明的主要优点包括：
[0152]
本发明提供了衣康酸在治疗tet酶相关疾病中的应用，具有以下优点：
[0153]
1)衣康酸是天然代谢物小分子，安全有效。
[0154]
2)衣康酸在巨噬细胞中靶点专一，对除tet酶以外的α-酮戊二酸依赖性酶活性无影响，副作用小。
[0155]
3)本发明发现tet2基因剔除小鼠的仍然发育正常，因此tet2作为药物靶点具有高安全性。
[0156]
4)本发明发现衣康酸与tet家族酶的共有活性中心结合，对tet家族酶均有抑制作用，应用面广泛。
[0157]
4)衣康酸专一性抑制tet家族酶及其在抗炎症类疾病过程中的效应，为开发新型高效的tet抑制剂提供了以衣康酸为起点的药效团(pharmacophore)。
[0158]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0159]
实施例1衣康酸特异性抑制tet2
[0160]
1.1ita体外抑制tet2酶活水平
[0161]
在本实施例中，检测了衣康酸对tet的体外抑制作用。通过基于固定底物dna和5hmc荧光检测的体外酶活性体系(图1a)检测5mc到5hmc的转化(表征tet酶活水平)。
[0162]
结果：ita能抑制mtet2
cd
的体外酶活，并且其半抑制浓度(ic50)为171μm(图1b)，ic50与l型2-羟基戊二酸(l-2-hg，115μm)相似，显著高于d-2-hg(1,057μm)、琥珀酸(》5mm)和延胡索酸(》5mm)。
[0163]
1.2外源性ita抑制tet家族酶在细胞中的作用
[0164]
本发明人用辛基修饰的ita(oi)或未修饰的ita处理tet2
+/+
和tet2-/-小鼠骨髓源性巨噬细胞(bmdms)，确定ita是否能抑制tet家族酶在细胞中的作用。
[0165]
结果：在tet2
+/+
的bmdms中外源性添加oi或ita可使整体5hmc降低高达95％，但在tet2-/-细胞中几乎没有影响，并且检测到tet2-/-细胞中5hmc的基础水平相对于tet2
+/+
细胞降低了约92％(图1c)。
[0166]
本实施例的结果表明，tet2是控制巨噬细胞中5hmc产生的关键tet酶，并且外源ita几乎可以完全抑制tet2。
[0167]
1.3炎症反应产生的ita对tet酶的抑制作用
[0168]
在本实施例中，采用lps诱导细胞产生炎症反应，观察炎症反应产生的ita对tet酶的抑制作用。
[0169]
使用lps处理raw264.7巨噬细胞30分钟后观察到irg1 mrna水平上升，2小时后蛋
白开始积累。对应地，检测到细胞内源性ita在lps刺激后2-4小时内迅速积累到毫摩尔水平，最高可达到3.75mm。并且ita的积累可以在irg1基因缺失后完全消除(图1d)。通过lc-ms/ms(图1e)，发现在irg1-wt raw264.7细胞中，整体5hmc在lps刺激下降低，但在irg1缺失(irg1-ko)细胞中始终保持相对较高的水平。此外，lps诱导的ita对raw264.7细胞的整体组蛋白甲基化没有影响(图1f)。
[0170]
本实施例中，lps刺激后的irg1表达水平上升，其产物ita也迅速累积，表征tet酶活水平的5hmc也随之出现下降。该结果表明，炎症反应中由irg1产生的ita可以选择性地抑制tet酶。并且，ita对酮戊二酸依赖的其他酶，如组蛋白去甲基化酶kdm并未产生影响，证明ita具有针对tet酶的特异性。
[0171]
实施例2衣康酸抑制tet2和阻止nf-κb及干扰素通路等炎症相关基因表达
[0172]
2.1ita抑制tet酶作用的转录组分析
[0173]
在本实施例中，为进一步探究ita对tet酶的抑制作用，比较了在lps刺激的raw264.7细胞中，由oi处理(抑制tet2催化活性)或tet2缺失(tet2-ko)引起的转录组变化。
[0174]
结果：在tet2-wt细胞中，发现1846个基因在oi处理后下调，其中712个基因属于能被lps激活上调的基因，且上调至少2倍。在这712个基因中，509个(71.5％)也因tet2缺失而下调(图2a)。这些基因有许多参与了先天免疫和炎症反应，包括细胞因子介导的信号通路，如tnf、toll样受体和nf-κb。
[0175]
本实施例证明，相当一部分lps诱导、与先天免疫和炎症反应相关的基因受到ita和tet2的调控。
[0176]
2.2ita通过抑制tet2的催化活性影响基因表达的机制
[0177]
tet2既有依赖其催化活性的功能，又有不依赖活性的功能。在本实施例中，验证了ita通过抑制tet2的催化活性影响基因表达的机制。
[0178]
本发明人构建了tet2h1795r敲入(ki)的点突变小鼠(小鼠tet2中的h1795相当于人类急性髓系白血病中高频率突变的位点tet2 h1881，该位点对tet2的催化活性至关重要)。然后分离tet2
+/+
和tet2h1795r(tet2-ki)的bmdm(骨髓来源巨噬细胞)，分别用lps单独或联合oi处理，然后进行基因表达谱分析。
[0179]
结果：在lps诱导并经oi处理后下调的1463个基因中，有607个基因(41.5％)同时也在tet2-ki细胞中下调。对这607个基因的kegg信号通路进行分析，发现与tet2-ko细胞类似，其中也富集了参与固有免疫和炎症反应的基因。
[0180]
本实施例的结果证明，ita对于tet2的催化活性也有一定的抑制作用，能够下调基于tet2的催化活性表达的固有免疫和炎症反应相关基因。
[0181]
实施例3衣康酸通过抑制tet2保护小鼠抵抗内毒素血症
[0182]
在本实施例中，验证了irg1/ita/tet2轴的功能意义。
[0183]
本发明人通过移植来自无催化活性的tet2
hxd
敲入(ki)突变体或野生型(wt)小鼠的骨髓细胞，开发了嵌合小鼠。tet2
hxd ki突变小鼠在小鼠tet2中含有h1295y和d1297a双取代突变，分别相当于人类tet2 h1382和h1384，能够破坏与必需辅因子fe2+的结合。
[0184]
将两种移植小鼠(野生型骨髓移植及突变型移植小鼠)提前12小时接收50mg/kg腹腔注射的ita，随后腹腔注射25mg/kg的lps进行内毒素模型的造模(图3a)。四小时造模后收取小鼠的腹腔白细胞与血浆，通过商业化的elisa试剂盒检测血清中细胞因子的表达，谷丙
转氨酶alt和谷草转氨酶ast(肝损伤标志物)的活性，并收集肺部组织的测量干湿重比例(肺水肿指标)，进行he组化染色(肺损伤指标)。
[0185]
结果：与wt嵌合小鼠相比，tet2
hxd
嵌合小鼠中lps诱导的炎症反应受到抑制，包括降低血清中促炎细胞因子和趋化因子(如il-6、tnf-α、cxcl9)的水平(图3b)，减轻肝损伤(图3c)、肺水肿(图3d)以及肺损伤(图3e-f)并延长生存期(图3g)。并且，在给经过ita预处理的wt嵌合小鼠注射lps后，也能够观察到上述由tet2催化失活引起的分子、组织和大体方面的炎症反应抑制(图3b-g)。
[0186]
本实施例的结果提供了直接的体内证据，证明tet2是ita的主要功能靶点。在针对并且irg1/ita/tet2轴在免疫调节中起着关键的生理作用。
[0187]
实施例4衣康酸抑制tet3酶
[0188]
在本实施例中，在hek293t细胞中过表达带有flag标签的tet3，用对应浓度的辛基修饰的衣康酸或者衣康酸处理细胞。通过液相色谱-质谱检测细胞中tet3酶代谢产物5hmc的相对含量。
[0189]
结果：如图4所示，相较于对比组，衣康酸及辛基修饰的衣康酸处理组5hmc均显著下降。本实施例证明衣康酸及辛基修饰的衣康酸均能在过表达tet3酶的细胞中有效抑制5hmc的生成，提示其对tet3酶具有显著的抑制作用。
[0190]
讨论
[0191]
一方面，在既往针对衣康酸的研究中，虽然也有对衣康酸医药用途功能的报道，但由于其机理始终不明确，故无法针对性地利用衣康酸，最大化其治疗效果。针对该问题，本发明的动物实验结果表明腹腔注射衣康酸可以有效缓解lps诱导的内毒素血症，具体表现为降低血浆细胞因子水平，避免肺水肿和肝损伤，并延长小鼠生存周期；在tet2酶活缺失的小鼠中，衣康酸则不具备上述抗炎和保护机体的功效。该结果有力地证明了衣康酸缓解内毒素血症的作用是通过抑制tet2酶活产生的。
[0192]
据此，本发明提供了检测tet2活性的试剂与衣康酸的联合应用，以便实现对炎症的精准治疗。
[0193]
另一方面，tet酶的催化活性依赖α-酮戊二酸激活，事实上机体内依赖α-酮戊二酸激活的酶种类繁多，应用竞争性结合其活性中心的抑制剂时，往往会对其他酶也产生影响。但本发明的衣康酸是首个tet家族酶特异性抑制剂，尤其是特异性抑制tet2，其仅对tet酶活性产生抑制作用，而对与tet酶同样依赖α-酮戊二酸激活的其他多种酶则无抑制。
[0194]
具体地，本发明通过实验证明，lps诱导的ita对巨噬细胞的整体组蛋白甲基化没有影响。这说明ita对α-酮戊二酸依赖的其他酶，如组蛋白去甲基化酶kdm并未产生影响，证明ita具有针对tet酶的特异性。因此本发明的方法能够在治疗细胞因子风暴的同时，避免对其他正常的酶功能产生干扰。
[0195]
进一步地，由于tet家族酶(即tet1、tet2和tet3)具有相同的活性中心，均依赖与α-酮戊二酸相结合发挥酶活性作用，并且本发明的衣康酸药物正是通过与α-酮戊二酸竞争性结合活性中心，抑制酶活性而发挥作用，因此，本发明能够起到广谱地抑制tet家族酶的效果。并且，在实施例中已证明了衣康酸对tet3酶也具有结合和中和活性，能够抑制其代谢产物5hmc的生成。因此，本发明在治疗tet家族酶相关疾病中具有广泛的应用前景。
[0196]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独
引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种制剂组合，其特征在于，所述制剂组合包括：(a)药物组合物，其含有衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂作为活性成分；(b)检测tet酶的试剂。2.如权利要求1所述的制剂组合，其特征在于，所述的tet酶包括：tet2、tet3、或其组合。3.如权利要求1所述的制剂组合，其特征在于，所述的检测tet酶的试剂为检测tet酶活性的试剂。4.如权利要求3所述的制剂组合，其特征在于，所述检测tet酶活性指检测tet酶催化产物的含量，优选地，指检测dna的5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)含量。5.如权利要求1所述的制剂组合，其特征在于，所述的制剂组合用于实施预防和/或治疗tet酶增多或tet酶活性上调相关疾病的方法。6.如权利要求5所述的制剂组合，其特征在于，所述的tet酶为tet2，并且所述的疾病为细胞因子风暴相关疾病。7.如权利要求6所述的制剂组合，其特征在于，所述的细胞因子风暴相关疾病包括：细菌或病毒感染性疾病、自身免疫性疾病、或其组合。8.如权利要求1-7中任一项所述的制剂组合的用途，其特征在于，用于制备治疗tet酶增多或活性上调相关疾病的试剂盒。9.一种衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂的用途，其特征在于，用于制备治疗tet酶相关疾病的制剂或药物组合物。10.一种体外非治疗性的抑制tet酶活性的方法，包括步骤：将tet酶与衣康酸、或其药学上可接受的盐、或其衍生物、或其促进剂解除，从而抑制所述tet酶的活性。

技术总结
本发明提供了衣康酸在治疗Tet酶相关疾病中的应用。具体地，本发明提供了衣康酸通过抑制Tet酶活性，治疗Tet酶相关疾病，尤其是细胞因子风暴相关疾病的用途。本发明证实腹腔注射代谢物小分子衣康酸，能使小鼠抵抗LPS诱导的内毒素血症，具体表现为降低细胞因子水平，缓解肺水肿和肝损伤，并延长小鼠生存期。衣康酸天然存在、安全有效，具有开发Tet酶相关疾病治疗药物的应用前景。疗药物的应用前景。


技术研发人员：熊跃 叶丹 陈磊蕾
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2022.01.19
技术公布日：2023/7/31