一种pH敏感性复方载药微球及其制备方法和用途

一种ph敏感性复方载药微球及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种ph敏感性复方载药微球及其制备方法和用途。


背景技术：

2.特发性肺纤维化是一类进行性疾病，其发病机制暂不明确，目前尚缺乏有效的治疗手段，fda批准用于ipf治疗的药物仅有吡非尼酮和尼达尼布两种。肺纤维化的发生和发展具有多机制的特点，单一的治疗药物作用效果有限。2014年10月，fda批准吡非尼酮用于ipf者治疗，其主要抗纤维化作用机制为抑制tgf-β，但其口服制剂存在恶心，皮疹，上呼吸道感染等不良反应的问题，单一治疗效果并不理想。
3.此外，目前上市的吡非尼酮等药物多为口服制剂，存在胃肠道的吸收屏障、首过效应、缺少靶向性、副作用大等缺点。由于吸入制剂可以有效提高药物在肺部的分布，用于肺纤维化治疗具有优势，近年来受到广泛关注。静电喷雾技术用于微球制备具有良好的包封率，可控的粒径大小。
4.吸入粉雾剂指的是微粉化药物单独或者与适宜的载体混合后，采取胶囊、泡囊或者多剂量贮库的形式，使用特制的干粉吸入装置，由患者吸入雾化药物递送到肺部的吸入制剂。粉雾剂较气雾剂和喷雾剂相比，具有不需要抛射剂与其他压缩气体作为动力，可由患者自主吸入的优势。
5.静电喷雾技术是一种较为新颖的制备生物材料的方法，其原理是采用高压静电作用，使针头处充满静电，当静电力高于溶液的表面张力时，产生具有一定粒径的液滴，在液滴到接受板的过程中，由于外加电场和表面张力的作用，溶剂挥发，得到干燥的微粒。静电喷雾技术制备的微粒具有可调控的粒径，可以制备具有核壳结构的微粒，可以应用于热敏性材料。
6.在硕士论文中，刘玉隆通过静电喷雾制备尼达尼布载药微球以治疗ipf，虽然微球具有良好的载药性能以及合适的粒径，通过peg修饰白蛋白能够减少微球的清除，但是肺部的微环境呈现弱酸性，靶向性较弱，此外，单药的治疗缺少多靶点的抑制效果。邹谊通过静电喷雾技术构建吡非尼酮载药微球，该微球由peg及壳聚糖组成，具有良好的载药量及包封率。但是，单独使用吡非尼酮只能抑制单一的信号通路，治疗策单一。此外，peg与壳聚糖通过化学键连接，在酸性环境下不能及时脱去peg，影响载体摄取。


技术实现要素：

7.针对上述技术问题，本发明提供一种ph敏感性复方载药微球及其制备方法和用途，具有ph敏感性，采用具有ph敏感键的peg修饰聚赖氨酸及白蛋白为载体材料，通过同轴静电喷雾技术，制备载吡非尼酮-棉酚白蛋白微球。本发明构建的ph响应性复方白蛋白微球具有良好的粉体学性质，可增加在肺部的滞留，并具有肺纤维化微环境响应性，增加药物摄取，提高抗肺纤维化效果。
8.注意，这些目的的记载并不妨碍其他目的的存在。本发明的一个方式并不需要实现所有上述目的。可以从说明书、附图、权利要求书的记载中抽取上述目的以外的目的。
9.棉酚(gos)由棉籽中分离得到，对卵巢及子宫内膜、肌层甾体激素受体有抑制作用，用于子宫功能性出血、子宫肌瘤并月经过多及子宫内膜异位症等临床治疗。转化生长因子-β(tgf-β)在ipf进展发挥了重要作用，此外，肺纤维化组织乳酸分泌显著高于正常组织，进一步增加tgf-β的表达水平，tgf-β与乳酸之间存在正反馈调节机制，本发明提出以吡非尼酮与棉酚为复方的治疗方法。
10.所述吡非尼酮(pfd)的结构式如下：
[0011][0012]
所述棉酚(gos)的结构式如下：
[0013][0014]
肺纤维化微环境具有弱酸性微环境特点，本发明以ph敏感型聚合物与白蛋白为复合载体，使微球具有共载药物、ph敏感性、良好的流动性与分散性等优势。
[0015]
本发明白蛋白微球用于肺纤维化的治疗，同时包载吡非尼酮与棉酚。ph敏感键增加微球在病灶部位的滞留；peg修饰微球，减少巨噬细胞的摄取作用。同时，微球高载药率和包封率，减少药物的突释性，亲水性材料的选择，有利于肺部的清除，减少肺部的蓄积。构建的微球具有良好的分散性，肺部沉积率与排空率。
[0016]
本发明白蛋白微球，其主要包括以下组分：ph敏感性材料聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸peg-pll、牛血清白蛋白、吡非尼酮及棉酚。ph敏感性材料聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸主要包括以下组分：对甲醛苯甲酸、聚乙二醇单甲醚、聚赖氨酸，通过酯化反应将对甲醛苯甲酸与聚乙二醇单甲醚反应得到具有醛基化聚乙二醇单甲醚，通过醛基化聚乙二醇单甲醚的醛基与聚赖氨酸氨基反应，得到具有ph敏感性的亚胺键连接的聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸。
[0017]
本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
[0018]
一种ph敏感性复方载药微球，包括以下化学组分：具有ph敏感性的聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸peg-pll、白蛋白、聚氧化乙烯、碳酸氢铵、亮氨酸、吡非尼酮和棉酚。
[0019]
上述方案中，所述白蛋白的质量分数为1％-10％，peg-pll的质量分数为1％-5％，聚氧化乙烯的质量分数为0.1％-1％，亮氨酸的质量分数为0.1％-1.2％，碳酸氢铵的质量分数为0.1％-1％，棉酚的质量分数为0.1％-0.5％，吡非尼酮的质量分数为0.1-1％。
[0020]
进一步的，所述白蛋白的质量分数为3％，peg-pll的质量分数为1％，聚氧化乙烯的质量分数为0.2％，亮氨酸的质量分数为0.6％，碳酸氢铵的质量分数为0.3％，棉酚的质量分数为0.1％，吡非尼酮的质量分数为0.3％。
[0021]
一种根据所述的ph敏感性复方载药微球的制备方法，包括以下步骤：
[0022]
将具有ph敏感性的聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸、白蛋白、聚氧化乙烯、碳酸氢铵、亮氨酸、的水溶液作为外轴溶液；将吡非尼酮与棉酚溶于含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物的丙酮溶液中，作为内轴工作液；设定静电喷雾参数，进行静电喷雾，制备得到ph敏感性复方载药微球。
[0023]
上述方案中，所述静电喷雾参数为：外轴流速为0.04-0.06mm/min；内轴流速为0.02-0.04mm/min；设定电压为18-26kv。
[0024]
进一步的，所述静电喷雾参数为：外轴流速为0.05mm/min；内轴流速为0.03mm/min；设定电压为26kv。
[0025]
上述方案中，所述ph敏感性复方载药微球的几何粒径为1-5μm，电位为-20-18mv。
[0026]
上述方案中，所述ph敏感性复方载药微球的卡尔指数为15％-20％的卡尔指数为15％-20％；引湿性为3.5％-6.5％。
[0027]
上述方案中，所述ph敏感性复方载药微球的棉酚包封率为75.2％-84.6％，棉酚载药率为2.11％-4.94％；所述ph敏感性复方载药微球的吡非尼酮包封率为76.6％-86.2％，吡非尼酮载药率为2.21％-12.17％。
[0028]
一种根据所述的ph敏感性复方载药微球在制备用于治疗特发性肺纤维化试剂中的用途。
[0029]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0030]
本发明复方给药通过调控tgf-β/乳酸正反馈通路的协同作用机制，发挥联合作用效果，提高疗效，降低副作用。采用ph敏感性白蛋白微球包载吡非尼酮及棉酚用于肺纤维化治疗药剂的制备。一方面，ph敏感性可使白蛋白微球在肺纤维化部位增加摄取，提高药物利用度；另一方面，修饰于白蛋白微球的聚乙二醇单甲醚使其减少被巨噬细胞的吞噬作用，延长微球的滞留时间。
[0031]
注意，这些效果的记载不妨碍其他效果的存在。本发明的一个方式并不一定必须具有所有上述效果。可以从说明书、附图、权利要求书等的记载显而易见地看出并抽出上述以外的效果。
附图说明
[0032]
图1为本发明实施例1中载药微球的扫描电镜图。
[0033]
图2为本发明测试例1中空白载体的生物安全性。
[0034]
图3为本发明测试例3中载药微球被肺成纤维细胞的摄取情况。
[0035]
图4为本发明测试例4中载药微球巨噬细胞的逃逸情况。
具体实施方式
[0036]
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]
实施例1
[0038]
称取牛血清白蛋白1000mg、peg-pll 500mg、聚氧化乙烯100mg、亮氨酸120mg、碳酸氢铵100mg溶于10ml水中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为外轴溶液。称取棉酚50mg，吡非尼酮100mg，聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga10mg溶于10ml丙酮中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为内
轴溶液。将溶液注入静电纺丝机，设定外轴流速0.04mm/min，内轴流速0.02mm/min，电压18kv，静电喷雾得到ph敏感性的载药白蛋白微球，30℃真空干燥24h，收集产物于避光干燥条件下保存。通过扫描电子显微镜观察实施例1中ph敏感性的吡非尼酮微球形态，图1为ph敏感性的载药微球形态。
[0039]
对制备的载药微球进行理化性能测定，其粒径为1μm，电位为-12mv，卡尔指数为20％，引湿性为6.5％，棉酚包封率与载药量为75.2％和2.16％，吡非尼酮包封率与载药量为76.6％和4.02％。
[0040]
实施例2
[0041]
称取牛血清白蛋白100mg、peg-pll 100mg、聚氧化乙烯10mg、亮氨酸10mg、碳酸氢铵10mg溶于10ml水中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为外轴溶液。称取棉酚10mg，吡非尼酮10mg，plga10mg溶于10ml丙酮中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为内轴溶液。将溶液注入静电纺丝机，设定外轴流速0.04mm/min，内轴流速0.03mm/min，电压22kv，静电喷雾得到ph敏感性的载吡非尼酮白蛋白微球，30℃真空干燥24h，收集产物于避光干燥条件下保存。
[0042]
对制备的载药微球进行理化性能测定，其粒径为5μm，电位为6mv，卡尔指数为19％，引湿性为6.3％，棉酚包封率与载药量为76.4％和2.66％，吡非尼酮包封率与载药量为78.2％和2.21％。
[0043]
实施例3
[0044]
称取牛血清白蛋白300mg、peg-pll 100mg、聚氧化乙烯20mg、亮氨酸60mg、碳酸氢铵30mg溶于10ml水中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为外轴溶液。称取棉酚10mg，吡非尼酮30mg，plga 10mg溶于10ml丙酮中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为内轴溶液。将溶液注入静电纺丝机，设定外轴流速0.05mm/min，内轴流速0.03mm/min，电压26kv，静电喷雾得到ph敏感性的载药白蛋白微球，30℃真空干燥24h，收集产物于避光干燥条件下保存。
[0045]
对制备的载药微球进行理化性能测定，其粒径为1.2μm，电位为-20mv，卡尔指数为15％，引湿性为3.5％，棉酚包封率与载药量为84.6％和4.94％，吡非尼酮包封率与载药量为86.2％和12.17％。
[0046]
实施例4
[0047]
称取牛血清白蛋白400mg、peg-pll 200mg、聚氧化乙烯20mg、亮氨酸40mg、碳酸氢铵40mg溶于10ml水中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为外轴溶液。称取棉酚20mg，吡非尼酮10mg，plga10mg溶于10ml丙酮中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为内轴溶液。将溶液注入静电纺丝机，设定外轴流速0.06mm/min，内轴流速0.04mm/min，电压22kv，静电喷雾得到ph敏感性的载药白蛋白微球，30℃真空干燥24h，收集产物于避光干燥条件下保存。
[0048]
对制备的载药微球进行理化性能测定，其粒径为4μm，电位为8mv，卡尔指数为18％，引湿性为4.7％，棉酚包封率与载药量为78.3％和4.11％，吡非尼酮包封率与载药量为80.2％和2.62％。
[0049]
实施例5
[0050]
称取牛血清白蛋白500mg、peg-pll 200mg、聚氧化乙烯25mg、亮氨酸60mg、碳酸氢铵50mg溶于10ml水中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为外轴溶液。称取棉酚15mg，吡非尼酮25mg，plga 10mg溶于10ml丙酮中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为内轴溶液。将溶液注入静电纺丝机，设定外轴流速0.05mm/min，内轴流速0.03mm/min，电压26kv，静电喷雾得到ph敏感
性的载药白蛋白微球，30℃真空干燥24h，收集产物于避光干燥条件下保存。
[0051]
对制备的载药微球进行理化性能测定，其粒径为2.3μm，电位为-9mv，卡尔指数为17％，引湿性为4.3％，棉酚包封率与载药量为77.5和3.41％，吡非尼酮包封率与载药量为82.7％和4.33％。
[0052]
实施例6
[0053]
称取牛血清白蛋白350mg、peg-pll 350mg、聚氧化乙烯20mg、亮氨酸45mg、碳酸氢铵80mg溶于10ml水中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为外轴溶液。称取棉酚10mg，吡非尼酮60mg，plga10mg溶于10ml丙酮中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为内轴溶液。将溶液注入静电纺丝机，设定外轴流速0.05mm/min，内轴流速0.03mm/min，电压26kv，静电喷雾得到ph敏感性的载药白蛋白微球，30℃真空干燥24h，收集产物于避光干燥条件下保存。
[0054]
对制备的载药微球进行理化性能测定，其粒径为3μm，电位为18mv，卡尔指数为19％，引湿性为6.1％，棉酚包封率与载药量为78.5和2.28％，吡非尼酮包封率与载药量为81.3％和10.84％。
[0055]
测试例1
[0056]
以3t6细胞为模型细胞，采用mtt法考察ph敏感性白蛋白微球空白载体对细胞的抑制作用。
[0057]
细胞培养基的配置：用移液枪移取89ml的dmem基础培养基，然后再向其中依次加入10ml的解冻的胎牛血清和1ml青链霉素，用移液枪吹打均匀即制得3t6细胞所需的dmem培养基，封口将其放入4℃冰箱中无菌保存。
[0058]
细胞培养：用配置的无菌dmem培养基在环境为37℃、5％co2的细胞培养箱中培养3t6细胞，培养过程中每天给细胞更换一次培养基并在显微镜下观察细胞的生长状态。培养3d左右观察细胞的生长数量长至约细胞培养瓶面积的85％左右时可以对细胞进行传代培养。细胞传代过程中用移液枪移取培养瓶中的培养基，加入2ml的pbs清洗两遍，然后加入1ml0.25％的胰酶，放到细胞培养箱中消化贴壁的细胞，消化3～5min左右，取出放在显微镜下观察贴壁的细胞被完全消化下来后加入2ml的dmem培养基终止消化，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入新的高糖培养基溶液进行吹打，吹打均匀后以1:4移入新培养瓶中进行传代培养，细胞传代培养至3代以后进行种板。
[0059]
接种与给药：将传至3代的3t6细胞用胰酶消化，加入2ml的pbs清洗两遍，然后加入1ml0.25％的胰酶，放到细胞培养箱中消化贴壁的细胞，消化3-5min左右，取出放在显微镜下观察贴壁的细胞被完全消化下来后加入2ml的dmem培养基终止消化，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入2ml的dmem培养基，用移液枪吹打均匀，取10μl于细胞计数板中计数，计数后再加入一定量的dmem培养基调整所需的细胞密度，接种密度为每孔5
×
104个3t6细胞，接种后将其放入环境为37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h。待细胞贴壁长至约细胞培养板面积的85％时，加入各浓度微球溶液后继续培养24h，所用微球与实施例3的区别在于不包括棉酚与吡非尼酮。培养结束后，所有实验孔中加入mtt溶液置于恒温培养箱中避光培养4h后加入dmso溶液，然后用酶标仪测定各实验孔在490nm波长处吸光度，记录吸光度值，计算细胞存活率，结果见图2，细胞存活率均在85％以上，可见本发明设计的蛋白载体具有良好的细胞安全性。
[0060]
测试例2
[0061]
以3t6细胞为模型细胞，采用mtt法考察联合给药对细胞的抑制作用。
[0062]
细胞培养基的配置：用移液枪移取89ml的dmem基础培养基，然后再向其中依次加入10ml的解冻的胎牛血清和1ml青链霉素，用移液枪吹打均匀即制得3t6细胞所需的dmem培养基，封口将其放入4℃冰箱中无菌保存。
[0063]
3t6细胞培养：用配置的无菌dmem培养基在环境为37℃、5％co2的细胞培养箱中培养3t6细胞，培养过程中每天给细胞更换一次培养基并在显微镜下观察细胞的生长状态。培养3d左右观察细胞的生长数量长至约细胞培养瓶面积的85％左右时可以对细胞进行传代培养。细胞传代过程中用移液枪移取培养瓶中的培养基，加入2ml的pbs清洗两遍，然后加入1ml0.25％的胰酶，放到细胞培养箱中消化贴壁的细胞，消化3～5min左右，取出放在显微镜下观察贴壁的细胞被完全消化下来后加入2ml的dmem培养基终止消化，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入新的高糖培养基溶液进行吹打，吹打均匀后以1:4移入新培养瓶中进行传代培养，细胞传代培养至3代以后进行种板。
[0064]
raw264.7细胞培养：用配置的无菌dmem培养基在环境为37℃、5％co2的细胞培养箱中培养raw264.7细胞，培养过程中每天给细胞更换一次培养基并在显微镜下观察细胞的生长状态。培养3d左右观察细胞的生长数量长至约细胞培养瓶面积的85％左右时可以对细胞进行传代培养。细胞传代过程中用移液枪移取培养瓶中的培养基，加入2ml的pbs清洗两遍，然后使用细胞刮板刮下半贴壁的细胞，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入新的高糖培养基溶液进行吹打，吹打均匀后以1:4移入新培养瓶中进行传代培养，细胞传代培养至3代以后进行种板。
[0065]
接种与给药：将传至3代的3t6细胞用胰酶消化，加入2ml的pbs清洗两遍，然后加入1ml0.25％的胰酶，放到细胞培养箱中消化贴壁的细胞，消化3-5min左右，取出放在显微镜下观察贴壁的细胞被完全消化下来后加入2ml的dmem培养基终止消化，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入2ml的dmem培养基，用移液枪吹打均匀，取10μl于细胞计数板中计数，计数后再加入一定量的dmem培养基调整所需的细胞密度，接种密度为每孔5
×
104个3t6细胞，接种后将其放入环境为37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h。将传至3代的raw264.7细胞用细胞刮板刮下，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入2ml的dmem培养基，用移液枪吹打均匀，取10μl于细胞计数板中计数，计数后再加入一定量的dmem培养基调整所需的细胞密度，接种密度为每孔5
×
104个raw264.7细胞，接种后将其放入环境为37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h。待细胞贴壁长至约细胞培养板面积的85％时，加入各浓度吡非尼酮pfd微球(与实施例3的区别是不含gos)，棉酚gos微球(与实施例3的区别是不含pfd)及复方载药微球溶液(采用实施例3的方法制备得到ph敏感性复方载药微球)后继续培养24h。培养结束后，所有实验孔中加入mtt溶液置于恒温培养箱中避光培养4h后加入dmso溶液，然后用酶标仪测定各实验孔在490nm波长处吸光度，记录吸光度值，计算细胞存活率，载药微球对3t6细胞的抑制效果，见表1，单独给予药物抑制3t6细胞生长时，pfd和gos的ic50分别为480.36μg/ml和8.62μg/ml。联合给药后，pfd和gos的ic50分别为131.08μg/ml和3.28μg/ml。联合指数ci＝131.08/480.36+3.28/8.62＝0.6533《1，可见本发明设计的载药载体具有良好的协同效应。
[0066]
表1药物的联合给药ic50
[0067][0068]
注：pfd-pp-bsa-ms:载吡非尼酮ph敏感性白蛋白微球，gos-pp-bsa-ms：载棉酚ph敏感性白蛋白微球，gos-pfd-pp-bsa-ms：ph敏感性复方白蛋白微球，pfd为吡非尼酮，pp为peg-pll缩写，bsa为牛血清白蛋白，ms为微球，gos为棉酚。
[0069]
测试例3
[0070]
载香豆素6ph敏感性白蛋白微球(c6-pp-bsa-ms)的制备：称取牛血清白蛋白300mg、peg-pll100 mg、聚氧化乙烯20mg、亮氨酸60mg、碳酸氢铵30mg溶于10ml水中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为外轴溶液。称取plga10 mg，香豆素62mg溶于10ml丙酮中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为内轴溶液。将溶液注入静电纺丝机，设定外轴流速0.05mm/min，内轴流速0.03mm/min，电压26kv，静电喷雾得到ph敏感性的载药白蛋白微球，30℃真空干燥24h，收集产物于避光干燥条件下保存。
[0071]
细胞培养基的配置：用移液枪移取89ml的dmem基础培养基，然后再向其中依次加入10ml的解冻的胎牛血清和1ml青链霉素，用移液枪吹打均匀即制得3t6细胞所需的dmem培养基，封口将其放入4℃冰箱中无菌保存。
[0072]
细胞培养：用配置的无菌dmem培养基在环境为37℃、5％co2的细胞培养箱中培养3t6细胞，培养过程中每天给细胞更换一次培养基并在显微镜下观察细胞的生长状态。培养3d左右观察细胞的生长数量长至约细胞培养瓶面积的85％左右时可以对细胞进行传代培养。细胞传代过程中用移液枪移取培养瓶中的培养基，加入2ml的pbs清洗两遍，然后加入1ml0.25％的胰酶，放到细胞培养箱中消化贴壁的细胞，消化3～5min左右，取出放在显微镜下观察贴壁的细胞被完全消化下来后加入2ml的dmem培养基终止消化，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入新的高糖培养基溶液进行吹打，吹打均匀后以1:4移入新培养瓶中进行传代培养，细胞传代培养至3代以后进行种板。
[0073]
细胞摄取：将传至3代的3t6细胞用胰酶消化，加入2ml的pbs清洗两遍，然后加入1ml0.25％的胰酶，放到细胞培养箱中消化贴壁的细胞，消化3-5min左右，取出放在显微镜下观察贴壁的细胞被完全消化下来后加入2ml的dmem培养基终止消化，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入2ml的dmem培养基，用移液枪吹打均匀，取10μl于细胞计数板中计数，计数后再加入一定量的dmem培养基调整所需的细胞密度，接种密度为每孔5
×
104个3t6细胞，接种后将其放入环境为37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h。待细胞贴壁长至约细胞培养板面积的85％时，将两份相同的c6-pp-bsa-ms分别分散于ph6.8与ph7.4的无菌pbs缓冲液中，加入到接种好的6孔板中孵育4h，加入4％多聚甲醛固定20min，加入dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色20min。通过倒置荧光显微镜观察不同溶液在3t6细胞中的摄取情况。结果见图3，其中coumarin 6是香豆素6，merge是香豆素的荧光图和dapi的荧光图叠加图，在ph6.8的弱酸性环境中，3t6细胞的荧光强度较正常生理条件下ph7.4有所增加。可见
本发明设计的白蛋白微球载体可以增加3t6细胞的摄取，增加药物的治疗效果。
[0074]
测试例4
[0075]
c6-pp-bsa-ms的制备：称取牛血清白蛋白300mg、peg-pll100 mg、聚氧化乙烯20mg、亮氨酸60mg、碳酸氢铵30mg溶于10ml水中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为外轴溶液。称取plga20 mg，香豆素62mg溶于10ml丙酮中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为内轴溶液。将溶液注入静电纺丝机，设定外轴流速0.05mm/min，内轴流速0.03mm/min，电压26kv，静电喷雾得到ph敏感性的载药白蛋白微球，30℃真空干燥24h，收集产物于避光干燥条件下保存。
[0076]
载香豆素6白蛋白微球(c6-bsa-ms)的制备：称取牛血清白蛋白300mg、聚氧化乙烯20mg、亮氨酸60mg、碳酸氢铵30mg溶于10ml水中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为外轴溶液。称取plga10 mg，香豆素2mg溶于10ml丙酮中，过0.45μm滤膜，取续滤液作为内轴溶液。将溶液注入静电纺丝机，设定外轴流速0.05mm/min，内轴流速0.03mm/min，电压26kv，静电喷雾得到ph敏感性的载药白蛋白微球，30℃真空干燥24h，收集产物于避光干燥条件下保存。
[0077]
细胞培养基的配置：用移液枪移取89ml的dmem基础培养基，然后再向其中依次加入10ml的解冻的胎牛血清和1ml青链霉素，用移液枪吹打均匀即制得3t6和raw264.7细胞所需的dmem培养基，封口将其放入4℃冰箱中无菌保存。
[0078]
细胞培养：用配置的无菌dmem培养基在环境为37℃、5％co2的细胞培养箱中培养raw264.7细胞，培养过程中每天给细胞更换一次培养基并在显微镜下观察细胞的生长状态。培养3d左右观察细胞的生长数量长至约细胞培养瓶面积的85％左右时可以对细胞进行传代培养。细胞传代过程中用移液枪移取培养瓶中的培养基，加入2ml的pbs清洗两遍，然后使用细胞刮板刮下半贴壁的细胞，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入新的高糖培养基溶液进行吹打，吹打均匀后以1:4移入新培养瓶中进行传代培养，细胞传代培养至3代以后进行种板。
[0079]
巨噬细胞逃逸：将传至3代的raw264.7细胞用细胞刮板刮下，在1000rpm下离心5min，弃去上清液，加入2ml的dmem培养基，用移液枪吹打均匀，取10μl于细胞计数板中计数，计数后再加入一定量的dmem培养基调整所需的细胞密度，接种密度为每孔5
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104个raw264.7细胞，接种后将其放入环境为37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h。待细胞贴壁长至约细胞培养板面积的85％时，向接种好的6孔板中分别加入c6-pp-bsa-ms和c6-bsa-ms游离的空白培养基稀释溶液孵育4h后，加入4％多聚甲醛固定20min后，加入dapi染色20min。通过倒置荧光显微镜观察不同溶液在raw264.7细胞中的摄取情况。结果见图4，其中coumarin 6是香豆素6，merge是香豆素的荧光图和dapi的荧光图叠加图，在相同的摄取时间下，经c6-pp-bsa-ms处理raw264.7细胞荧光强度低于c6-bsa-ms处理的raw264.7细胞荧光强度，可见本发明设计的白蛋白微球载体可以减少巨噬细胞的吞噬作用，增加肺部的作用时间。
[0080]
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种ph敏感性复方载药微球，其特征在于，包括以下化学组分：聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸peg-pll、白蛋白、聚氧化乙烯、碳酸氢铵、亮氨酸、吡非尼酮和棉酚。2.根据权利要求1所述的ph敏感性复方载药微球，其特征在于，所述白蛋白的质量分数为1％-10％，peg-pll的质量分数为1％-5％，聚氧化乙烯的质量分数为0.1％-1％，亮氨酸的质量分数为0.1％-1.2％，碳酸氢铵的质量分数为0.1％-1％，棉酚的质量分数为0.1％-0.5％，吡非尼酮的质量分数为0.1-1％。3.根据权利要求2所述的ph敏感性复方载药微球，其特征在于，所述白蛋白的质量分数为3％，peg-pll的质量分数为1％，聚氧化乙烯的质量分数为0.2％，亮氨酸的质量分数为0.6％，碳酸氢铵的质量分数为0.3％，棉酚的质量分数为0.1％，吡非尼酮的质量分数为0.3％。4.一种根据权利要求1-3任意一项所述的ph敏感性复方载药微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸、白蛋白、聚氧化乙烯、碳酸氢铵、亮氨酸、的水溶液作为外轴溶液；将吡非尼酮与棉酚溶于含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物的丙酮溶液中，作为内轴工作液；设定静电喷雾参数，进行静电喷雾，制备得到ph敏感性复方载药微球。5.根据权利要求4所述的ph敏感性复方载药微球的制备方法，其特征在于，所述静电喷雾参数为：外轴流速为0.04-0.06mm/min；内轴流速为0.02-0.04mm/min；设定电压为18-26kv。6.根据权利要求5所述的ph敏感性复方载药微球的制备方法，其特征在于，所述静电喷雾参数为：外轴流速为0.05mm/min；内轴流速为0.03mm/min；设定电压为26kv。7.根据权利要求4所述的ph敏感性复方载药微球的制备方法，其特征在于，所述ph敏感性复方载药微球的几何粒径为1-5μm，电位为-20-18mv。8.根据权利要求4所述的ph敏感性复方载药微球的制备方法，其特征在于，所述ph敏感性复方载药微球的卡尔指数为15％-20％的卡尔指数为15％-20％；引湿性为3.5％-6.5％。9.根据权利要求4所述的ph敏感性复方载药微球的制备方法，其特征在于，所述ph敏感性复方载药微球的棉酚包封率为75.2％-84.6％，棉酚载药率为2.11％-4.94％；所述ph敏感性复方载药微球的吡非尼酮包封率为76.6％-86.2％，吡非尼酮载药率为2.21％-12.17％。10.一种根据权利要求1-3任意一项所述的ph敏感性复方载药微球在制备用于治疗特发性肺纤维化试剂中的用途。

技术总结
本发明提供一种pH敏感性复方载药微球及其制备方法和用途，包括以下化学组分：具有pH敏感性的聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸PEG-PLL、白蛋白、聚氧化乙烯、碳酸氢铵、亮氨酸、吡非尼酮和棉酚。所述白蛋白的质量分数为1％-10％，PEG-PLL的质量分数为1％-5％，聚氧化乙烯的质量分数为0.1％-1％，亮氨酸的质量分数为0.1％-1.2％，碳酸氢铵的质量分数为0.1％-1％，棉酚的质量分数为0.1％-0.5％，吡非尼酮的质量分数为0.1-1％。本发明复方给药发挥联合作用效果，提高疗效，降低副作用。一方面，pH敏感性可使白蛋白微球在肺纤维化部位增加摄取，提高药物利用度；另一方面，修饰于白蛋白微球的聚乙二醇单甲醚使其减少被巨噬细胞的吞噬作用，延长微球的滞留时间。延长微球的滞留时间。延长微球的滞留时间。


技术研发人员：许颖 潘滨 辛渊蓉 屈阳 张娅琪
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/2