一种在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸形成的mRNA高产制备方法

一种在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸形成的mrna高产制备方法
技术领域
1.本发明涉及mrna的体外转录合成和核糖核酸分离纯化技术领域，具体涉及一种在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸形成的mrna高产制备方法。


背景技术：

2.mrna疫苗是分子生物学和免疫学相结合的新技术，与基因治疗密切相关。近十年来，mrna疫苗在流感病毒、寨卡病毒和狂犬病毒的有效免疫。特别是新冠疫情爆发后，mrna疫苗因其研发速度快、安全性高、可规模化及效率高等优点，逐渐成为研究的热点。非复制性的mrna通常通过体外转录制备，以线性化质粒dna为模板，通过rna聚合酶作用经酶促反应合成目标mrna，然后在mrna的5’端进行加帽和3’端加尾。因此体外转录得到的样品中通常包括rna聚合酶、残留ntp、dna模板、dsrna和异常终止转录的mrna等杂质。其中dsrna杂质对mrna疫苗的有效性和安全性有非常大影响，如降低翻译效率、引起炎症反应和免疫应激反应等，因此降低mrna产物中dsrna尤为重要。
3.体外转录过程中dsrna形成主要基于两种机制。第一种是基于rna依赖性rna聚合酶。体外转录产生的mrna，如果3’端具有一定互补性，可能发生反向折叠，在t7聚合酶作用下，以目的rna为模板进行延伸，形成顺式的3’端延伸dsrna。另外，短的转录本在退火条件与目的mrna互补序列特异性结合，形成短转录本-dsrna。第二种是基于dna依赖性独立于启动子的rna聚合酶，转录以非模板链作为模板，在不依赖启动子的t7聚合酶作用下，转录生成反义链rna，与目的rna互补形成dsrna。目前去除转录产物中dsrna的方法包括体外转录之后对mrna进行纯化除去dsrna或在体外转录过程中减少dsrna的产生。markus等通过纤维素层析的方法使dsrna在乙醇体系中与纤维素特异性结合，将dsrna水平降低了90％以上。us20200071689a1公开了一种去除体外转录产物中的dsrna的方法。在转录得到的mrna体系中加入rnase iii消化产物中的dsrna，此方法在去除dsrna的同时可以保护mrna不被酶切消化。但是此方法存在价格成本高，实验结束后仍需去除此酶，局限性较高。katalin等通过hplc法将dsrna与mrna分离后，mrna在细胞中翻译水平提高了10～1000倍。这些纯化的方法虽然可以降低mrna中dsrna的水平，但是mrna不稳定，纯化过程中易降解。
4.在体外转录过程中减少dsrna的产生是从根源上降低dsrna的水平。目前研究中主要从以下三个方面。(1)dna模板序列改造和修饰，在dna模板中添加polya尾巴序列，可以减少反义型dsrna产生；在rna合成过程中，n1-甲基-假尿苷修饰rna可能有助于减少反义rna链合成，提升蛋白表达量和降低免疫原性。加入3’端互补的dna序列，通过竞争捕获dna，可以有效防止3’端自延伸，减少3’端自延伸的dsrna的产生。(2)改造和修饰rna聚合酶。monica等使用耐热的rnap在高温下进行体外转录反应，3’端延伸的dsrna的显著降低，并且mrna产物显示出较低的免疫原性。heng xia等发现嗜冷噬菌体vsw-3编码的rna聚合酶在低温(4-25℃)下合成的rna中dsrna水平显著降低，其中3’端延伸和全长的dsrna几乎全部消除。moderna对t7聚合酶的氨基酸序列进行改造，t7聚合酶的g47a+884g突变之后，可以减少
dsrna的产生。(3)调节体外转录过程。在体外转录过程中将镁离子浓度降低至5mm以下可以降低3’端延伸的以及反义的dsrna的产生。在高盐条件下进行体外转录反应，通过抑制rna产物的重结合减少dsrna的产生，将启动子dna和t7 rna聚合酶固定化，提高编码rna的总产量和纯度。cn115087456公开了一种减少转录体系中双链rna形成的方法，在转录起始反应混合中加入至少一种离液剂可以减少或者抑制碱基间相互作用减少rna制备期间dsrna的形成。这些方法均能一定程度上减少dsrna的产生。但是，高温转录和特异竞争位点均会对mrna的生产增加经济负担，尤其针对工业生产中。离液盐虽然可以降低dsrna的合成，但是离液盐作为常用的蛋白质变性剂会影响t7酶的结构和活性，另外加入变性剂也会引入新杂质。此外，降低转录体系中的镁离子浓度和加入变性剂还会影响mrna的产量。因此通过其他方法寻找可以降低dsrna的产生又不影响体外转录和t7酶的方法尤为重要。
5.综上所述，目前用于去除和降低转录体系中dsrna水平存在操作复杂，成本高，mrna产量低和不稳定等问题。如何提供一种减少dsrna效率高、mrna产量高、成本低、且mrna稳定性好方法，已成为目前mrna体外合成和分离纯化技术领域亟待解决的问题之一。本发明提出了一种在体外转录过程中加入带负电荷固相介质减少dsrna产量并提升mrna产量和稳定性的方法，此方法采用的固相介质不溶于水，不会污染转录体系；在转录完成之后固相介质易分离，操作简单；固相介质经适当处理后可以重复使用，成本低廉，易用于大规模生产。


技术实现要素：

6.针对上述存在的技术局限性，即目前mrna中dsrna去除方法操作复杂、成本高、mrna产量低和稳定性差等问题，本发明提出了一种在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸(dsrna)形成的mrna高产制备方法；其实现了简单、高效地减少dsrna产生，提升了mrna的产量，并保证了mrna的稳定性，同时，该方法具有操作简单、无污染、成本低廉、易于规模放大应用，且固相介质可以重复使用的技术优势，克服了背景技术中提到的不足和缺陷。
7.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
8.本发明的发明点是提供一种在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸形成的mrna高产制备方法，所述制备方法是在转录过程中加入固相介质。
9.可选地，上述的mrna高产制备方法，所述固相介质为修饰有带负电荷基团的介质。
10.此修饰可在固相介质的任意位置，例如，在固相介质表面修饰有带负电荷的基团、在固相介质内部修饰有带负电荷的基团等。
11.可选地，上述的mrna高产制备方法，所述固相介质上修饰的负电荷基团为磺酸基-so3、甲基磺酸基-ch2so3、乙基磺酸基-(ch2)2so3、丙基磺酸基-(ch2)3so3、磷酸基po3、羧酸基-coo、甲酸基-ch2coo、羟基-oh、聚腺苷酸ploy a、聚胸苷酸ploy t、聚尿苷酸ploy u、聚鸟苷酸ploy g和聚胞苷酸ploy c中的一种或多种。
12.其中，ploy a(聚腺苷酸)、ploy t(聚胸苷酸)、ploy u(聚尿苷酸)、ploy g(聚鸟苷酸)、ploy c(聚胞苷酸)的聚合度n为1～100；聚合度和选择为1、5、10、15、20、25、50、75、100。
13.可选地，上述的mrna高产制备方法，所述固相介质的形态为颗粒状、膜状和片状中的一种或多种。
14.可选地，上述的mrna高产制备方法，
15.所述颗粒状固相介质包括微球和纳米颗粒中的一种或多种；
16.所述颗粒状固相介质的材质包括有机材料、无机材料和功能性材料中的一种或多种；
17.所述有机材料包括天然多糖类和合成高聚物中的一种或多种；
18.所述天然多糖类有机材料包括纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖和魔芋葡甘聚糖中的一种或多种；
19.所述合成聚合物包括苯乙烯类聚合物，丙烯酸类聚合物和聚乙烯酸类聚合物中的一种或多种；
20.所述无机材料包括硅胶、玻璃、金属氧化物和羟基磷灰石中的一种或多种；
21.所述功能性材料包括磁性材料和热敏性材料中的一种或多种；
22.所述膜状固相介质包括硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维素膜中的一种或多种；
23.所述片状固相介质包括碳纳米管。
24.可选地，上述的mrna高产制备方法，包括以下步骤：
25.s1.固相介质预处理：将固相介质用无菌无酶水清洗之后，用缓冲溶液平衡；
26.s2.配制mrna体外转录体系，并将固相介质加入转录体系混合物中，进行转录反应制备mrna；
27.s3.转录完成之后，采用离心或者重力沉降方法收集上清，获得mrna溶液。
28.可选地，上述的mrna高产制备方法，所述步骤s1中，预处理是将固相介质用无菌无酶水清洗之后，再以缓冲液冲洗，震荡平衡后抽干；所述缓冲液包括tris-hcl缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和hepes缓冲液中的一种或多种；所述震荡平衡时间为5-240min；平衡后的固相介质通过烧结玻璃滤器抽干。
29.缓冲液优选为tris-hcl缓冲液或磷酸盐缓冲液。
30.缓冲液浓度为0.01-1m，可选择为0.01m、0.05m、0.1m、0.3m、0.5m、0.7m、1m。
31.震荡平衡时间优选为60-240min，可选择为60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min。
32.可选地，上述的mrna高产制备方法，所述步骤s2中，固相介质的加入转录体系混合物的时机为转录起始阶段、转录过程阶段或转录后阶段，优选为转录起始阶段；固相介质的加入量为1-1000mg/ml，优选为10-600mg/ml，更优选为10-200mg/ml，可选择为10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml。
33.可选地，上述的mrna高产制备方法，所述步骤s2中，转录体系混合物包括反应缓冲液、dna模板、ntp、t7聚合酶、rnase a抑制剂和焦磷酸酶；转录反应温度为20-60℃，可选择为20℃、37℃、55℃、60℃，优选为37℃，转录时间为4h(0h为转录起始阶段，＞4h为转录后阶段)。
34.上述ntp的浓度可为2～8m，ntp中atp包括天然atp、n1-甲基腺苷(m1a)、n6-甲基腺苷(m6a)；ctp包括天然ctp或5-甲基胞苷(m5c)；utp包括天然utp、5-甲氧基尿苷(5mou)、假尿苷(ψ)或n1-甲基假尿苷(m1ψ)。
35.可选地，上述的mrna高产制备方法，所述步骤s3中，离心转速为8000-12000rpm/min，优选为10000rpm/min；离心时间为1-3min，优选为2min。
36.与现有技术相对比，本发明具有以下优点：
37.本发明所提供的在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸形成的mrna高产制备方法，在体外转录中加入不同种类带负电荷的固相介质，通过界面调控，减少了dsrna的产生，同时提升了mrna的产量和mrna的稳定性。此方法采用的固相介质不溶于水，不会污染转录体系；在转录完成之后固相介质易分离，操作简单；固相介质经适当处理后可以重复使用，成本低廉，易于放大到工业化规模生产中。
附图说明
38.图1显示为实施例3-1和对比例1和对比例2的hplc检测谱图。
39.图2显示为根据hplc检测峰面积计算得到的相对mrna产量。
40.图3显示为实施例3-1和对比例1和对比例2的琼脂糖凝胶电泳检测mrna产量。
41.图4显示为实施例3-1和对比例1和对比例2的dot blot检测dsrna产量。
具体实施方式
42.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
43.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。
44.为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
45.实施例1
46.一种在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸形成的mrna高产制备方法，是在转录过程中加入固相介质。
47.固相介质为修饰有带负电荷基团的介质；此修饰可在固相介质的任意位置，例如，在固相介质表面修饰有带负电荷的基团、在固相介质内部修饰有带负电荷的基团等。
48.固相介质上修饰的负电荷基团为磺酸基-so3、甲基磺酸基-ch2so3、乙基磺酸基-(ch2)2so3、丙基磺酸基-(ch2)3so3、磷酸基po3、羧酸基-coo、甲酸基-ch2coo、羟基-oh、聚腺苷酸ploy a、聚胸苷酸ploy t、聚尿苷酸ploy u、聚鸟苷酸ploy g和聚胞苷酸ploy c中的一种或多种。
49.其中，ploy a(聚腺苷酸)、ploy t(聚胸苷酸)、ploy u(聚尿苷酸)、ploy g(聚鸟苷酸)、ploy c(聚胞苷酸)的聚合度n为1～100；聚合度和选择为1、5、10、15、20、25、50、75、100。
50.固相介质的形态为颗粒状、膜状和片状中的一种或多种。
51.颗粒状固相介质包括微球和纳米颗粒中的一种或多种；
52.颗粒状固相介质的材质包括有机材料、无机材料和功能性材料中的一种或多种；
53.有机材料包括天然多糖类和合成高聚物中的一种或多种；
54.天然多糖类有机材料包括纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖和魔芋葡甘聚糖中的一种或多种；
55.合成聚合物包括苯乙烯类聚合物，丙烯酸类聚合物和聚乙烯酸类聚合物中的一种或多种；
56.无机材料包括硅胶、玻璃、金属氧化物和羟基磷灰石中的一种或多种；
57.功能性材料包括磁性材料和热敏性材料中的一种或多种；
58.膜状固相介质包括硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维素膜中的一种或多种；
59.片状固相介质包括碳纳米管。
60.mrna高产制备方法，具体包括以下步骤：
61.s1.固相介质预处理：将固相介质用无菌无酶水清洗之后，用缓冲溶液平衡；
62.s2.配制mrna体外转录体系，并将固相介质加入转录体系混合物中，进行转录反应制备mrna；
63.s3.转录完成之后，采用离心或者重力沉降方法收集上清，获得mrna溶液。
64.步骤s1中，预处理是将固相介质用无菌无酶水清洗之后，再以缓冲液冲洗，震荡平衡后抽干；缓冲液包括tris-hcl缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和hepes缓冲液中的一种或多种；震荡平衡时间为5-240min；平衡后的固相介质通过烧结玻璃滤器抽干。
65.缓冲液优选为tris-hcl缓冲液或磷酸盐缓冲液。
66.缓冲液浓度为0.01-1m，可选择为0.01m、0.05m、0.1m、0.3m、0.5m、0.7m、1m。
67.震荡平衡时间优选为60-240min，可选择为60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min。
68.步骤s2中，固相介质的加入转录体系混合物的时机为转录起始阶段、转录过程阶段或转录后阶段，优选为转录起始阶段；固相介质的加入量为1-1000mg/ml，优选为10-600mg/ml，更优选为10-200mg/ml，可选择为10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml。
69.步骤s2中，转录体系混合物包括反应缓冲液、dna模板、ntp、t7聚合酶、rnase a抑制剂和焦磷酸酶；转录反应温度为20-60℃，可选择为20℃、37℃、55℃、60℃，优选为37℃，转录时间为4h(0h为转录起始阶段，＞4h为转录后阶段)。
70.上述ntp的浓度可为2～8m，ntp中atp包括天然atp、n1-甲基腺苷(m1a)、n6-甲基腺苷(m6a)；ctp包括天然ctp或5-甲基胞苷(m5c)；utp包括天然utp、5-甲氧基尿苷(5mou)、假尿苷(ψ)或n1-甲基假尿苷(m1ψ)。
71.步骤s3中，离心转速为8000-12000rpm/min，优选为10000rpm/min；离心时间为1-3min，优选为2min。
72.实施例2
73.一种mrna高产制备方法，包括以下步骤：
74.s1.固相介质预处理：
75.将带有磺酸基-so3修饰的琼脂糖微球，用无菌无酶水清洗之后，再以经无菌无酶水配制的浓度为0.05m的tris-hcl缓冲液清洗和平衡，平衡时间为240min，使用前通过离心或者重力作用沉降和分离；
76.s2.mrna体外转录：
77.配制mrna体外转录体系，在转录反应起始阶段、即反应0h阶段将固相介质加入转录体系混合物中，转录反应制备mrna；其中，固相介质的加入量为100mg/ml，mrna转录体系
(反应体系100μl)的制备方法如下：
78.(1)配制10
×
transcription buffer(转录缓冲液)：400mm ph7.9的tris-hcl、60mm mgcl2、100mm dtt(二硫苏糖醇)、20mm亚精胺；
79.(2)将所需t7 rnapolymerase、rnase inhibitor(rna酶抑制剂)和焦磷酸酶置于冰上；atp、ctp、gtp、utp(假尿苷修饰的utp、n1-甲基假尿苷修饰的utp、5-甲基胞苷修饰的ctp、n1-甲基腺苷修饰的atp)混匀置于冰上，无菌无酶水、dna模板、10
×
transcription buffer置于室温备用；
80.(3)无菌无酶离心管中加入10
×
transcription buffer10μl、rnase free water 41.5μl、ntp(核苷三磷酸)8μl、dna模板30μl、t7 rnapolymerase 5μl、rnase inhibitor(rna酶抑制剂)4μl和焦磷酸酶1.5μl，轻轻混匀各组分，37℃孵育4h；
81.s3.转录完成之后，采用离心或者重力沉降方法收集上清，获得mrna溶液。
82.实施例3
83.体外转录中加入磺酸基修饰的不同种类的固相介质：
84.一种体外转录制备mrna过程中减少dsrna形成的方法，具体步骤如下：
85.与实施例2所述方法大体相同，区别之处在于所加入的磺酸基修饰的固相介质不同，转录体系中加入5mg磺酸基修饰的5种不同固相介质，分别制备5个100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物。
86.表1为所选择使用的磺酸基修饰的5种不同的固相介质。
87.表1
[0088][0089]
轻轻混匀各组分，37℃孵育4h；转录完成之后，分离转录混合物和固相介质。
[0090]
实施例4
[0091]
体外转录中加入不同基团修饰的琼脂糖微球介质：
[0092]
一种体外转录制备mrna过程中减少dsrna形成的方法，具体步骤如下：
[0093]
与实施例2所述方法大体相同，区别之处在于所加入的葡聚糖微球固相介质不同是以5种不同基团修饰的，转录体系中加入10mg的5种不同负电荷基团修饰的葡聚糖微球固相介质，分别制备5个100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物。
[0094]
表2为所选择使用的葡聚糖微球固相介质表面修饰的5种不同负电荷基团。
[0095]
表2
[0096][0097]
轻轻混匀各组分，37℃孵育4h；转录完成之后，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。当使用聚胸腺嘧啶修饰的固相介质时，会吸附少量转录合成的mrna。可以向微球中加入100μl的20mm tris-hcl+1m nacl(ph7.0)淋洗，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。然后向微球中加入100μl的无菌无酶水，置于摇床上，以180r/min于60℃洗脱1h。
以12000rpm离心2min分离洗脱样品和微球，即可将少量吸附在介质上的mrna进行回收。
[0098]
实施例5
[0099]
体外转录不同浓度的固相介质：
[0100]
一种体外转录制备mrna过程中减少dsrna形成的方法，具体步骤如下：
[0101]
与实施例2所述方法大体相同，区别之处在于所加入磺酸基修饰的葡聚糖-琼脂糖固相介质的浓度(加入量)不同，转录体系中以6种浓度加入量分别加入磺酸基修饰的葡聚糖-琼脂糖固相介质，制备6个100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物。
[0102]
表3为所选择使用的6种不同加入量的磺酸基修饰的葡聚糖-琼脂糖固相介质。
[0103]
表3
[0104]
序号123456固相介质加入量(mg/ml)1050100200400600
[0105]
轻轻混匀各组分，37℃孵育4h；转录完成之后，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。
[0106]
实施例6
[0107]
体外转录不同时间加入固相介质：
[0108]
一种体外转录制备mrna过程中减少dsrna形成的方法，具体步骤如下：
[0109]
与实施例2所述方法大体相同，区别之处在于所加入的5mg磺酸基修饰的琼脂糖微球固相介质分别是在不同时机加入的，将已平衡好的固相介质，在4个不同时机加入至转录体系中，制备4个100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物。
[0110]
表4为所选择使用的体外转录过程中固相介质的4种不同加入时机。
[0111]
表4
[0112]
序号1234转录时间(h)012＞4
[0113]
轻轻混匀各组分，37℃共孵育4h；转录完成之后，分离转录混合物和微球。
[0114]
实施例7
[0115]
体外转录中加入不同聚合长度的基团修饰的固相介质：
[0116]
一种体外转录制备mrna过程中减少dsrna形成的方法，具体步骤如下：
[0117]
与实施例2所述方法大体相同，区别之处在于转录体系中所加入的10mg固相介质，为4种不同聚合度的聚胸腺嘧啶修饰的固相介质(聚苯乙烯基质)，制备4个100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物。
[0118]
表5为所选择使用的聚胸腺嘧啶修饰的固相介质(聚苯乙烯基质)的4种不同聚合度。
[0119]
表5
[0120]
序号1234聚合度(n)10182550
[0121]
轻轻混匀各组分，37℃孵育4h；转录完成之后，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。对于该类介质，会吸附少量转录合成的mrna，可以向微球中加入100μl的20mm tris-hcl+1m nacl(ph 7.0)淋洗，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。然后向微
球中加入100μl的无菌无酶水，置于摇床上，以180r/min于60℃洗脱1h。以12000rpm离心2min分离洗脱样品和微球，即可将少量吸附在介质上的mrna进行回收。
[0122]
实施例8
[0123]
体外转录体系中的不同转录温度：
[0124]
一种体外转录制备mrna过程中减少dsrna形成的方法，具体步骤如下：
[0125]
与实施例2所述方法大体相同，区别之处在于转录体系中加入5mg羧酸基修饰的琼脂糖基质微球固相介质后，采用3种不同温度进行体外转录，制备3个100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物。
[0126]
表6为所选择使用的3种不同的体外转录温度。
[0127]
表6
[0128]
序号123温度(℃)203755
[0129]
孵育4h转录完成之后，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。
[0130]
实施例9
[0131]
不同修饰的ntp的体外转录中加入固相介质：
[0132]
一种体外转录制备mrna过程中减少dsrna形成的方法，具体步骤如下：
[0133]
与实施例2所述方法大体相同，区别之处在于转录体系中加入的ntp经过了4种不同的修饰，制备4个100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物。
[0134]
表7为体外转录中所选择使用的4种不同的ntp修饰。
[0135]
表7
[0136][0137]
在转录体系中分别加入5mg羧酸基修饰的葡聚糖微球，轻轻混匀各组分，37℃孵育4h；转录完成之后，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。
[0138]
实施例10
[0139]
在转录体系中重复使用固相介质：
[0140]
一种体外转录制备mrna过程中减少dsrna形成的方法，具体步骤如下：
[0141]
与实施例2所述方法大体相同，区别之处在于，制备100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物，加入5mg磺酸基的琼脂糖-葡聚糖微球介质，轻轻混匀各组分，37℃孵育4h；转录完成之后，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。向微球中加入100μl的20mm tris-hcl(ph 7.0)淋洗，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。然后向微球中加入100μl的20mm tris-hcl+1m nacl(ph 7.0)，置于摇床上，以180r/min于60℃洗脱1h。以12000rpm离心2min分离洗脱样品和微球。
[0142]
将洗脱后的微球置于20mm tris-hcl(ph 7.0)缓冲液中再次平衡，按照上述步骤将微球再重复使用两次。
[0143]
表8为体外转录过程中固相介质使用的次数。
[0144]
表8
[0145]
序号123固相介质使用次数(次)123
[0146]
实施例11
[0147]
多种固相介质混合使用：
[0148]
一种体外转录制备mrna过程中减少dsrna形成的方法，具体步骤如下：
[0149]
与实施例2所述方法大体相同，区别之处在于转录体系中加入了3组不同修饰的固相介质混合物，制备3个100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物。
[0150]
表9为体外转录中所选择使用的3组不同的固相介质混合物。
[0151]
表9
[0152][0153]
轻轻混匀各组分，37℃孵育4h；转录完成之后，以12000rpm离心2min分离转录混合物和固相介质。
[0154]
对比例1
[0155]
本对比例1为转录体系不加固相介质。
[0156]
不加固相介质的转录体系，操作过程为：取100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物，轻轻混匀各组分，37℃孵育4h。
[0157]
对比例2
[0158]
本对比例2为转录体系中加入无配基修饰的琼脂糖微球，与实施例3的第1组(加入磺酸基修饰的琼脂糖微球)区别在于，无配基修饰的琼脂糖微球的表面无负电荷基团修饰。
[0159]
加入无配基琼脂糖微球的转录体系，操作过程为：取100μl以绿色荧光蛋白的基因为模板的转录混合物，加入5mg无配基琼脂糖基质微球，轻轻混匀各组分，37℃孵育4h；转录完成之后，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。将微球中加入100μl的20mm tris-hcl(ph 7.0)淋洗，以12000rpm离心2min分离转录混合物和微球。然后将微球中加入100μl的20mm tris-hcl+1m nacl(ph 7.0),置于摇床上，以180r/min于60℃洗脱1h。以12000rpm离心2min分离洗脱样品和微球。
[0160]
对比例3
[0161]
本对比例3为转录体系中加入修饰有正电荷基团的琼脂糖微球，与实施例3的第1组(加入磺酸基修饰的琼脂糖微球)区别在于，本对比例中所加入的琼脂糖微球上修饰的基团带有正电荷。
[0162]
实施例12(测试例1)
[0163]
采用琼脂糖凝胶电泳法和hplc法对转录样品中mrna的进行定量，采用dot blot法对体外转录体系中的dsrna进行定量分析，计算实施例3-11获得的mrna的收率和dsrna的含
量，结果列于表10。
[0164]
mrna相对产量(％)＝加入固相介质组mrna浓度/未加固相介质组mrna浓度*100％。
[0165]
dsrna相对产量(％)＝加入固相介质组mrna中dsrna的含量/未加固相介质组mrna中dsrna的含量*100％。
[0166]
表10为对比例1-3和实施例3-11所获得mrna的相对产量(％)和dsrna的相对产量(％)统计结果对比；其中，实施例3表1中的第1项以“实施例3-1”表示，实施例3表1中的第2项以“实施例3-2”表示，其余依次类推。
[0167]
表10
[0168]
[0169]
[0170][0171]
实施例13(测试例2)
[0172]
对实施例3的第1组(实施例3-1)和对比例1和对比例2进行hplc测试，转录之后的样品经10倍稀释后通过hplc进行定量分析。
[0173]
mrna定量测试方法：转录后的样品通过sec-2000(300
×
7.8mm)分析柱(sepax，usa)上采用arc hplc系列(waters，usa)进行hplc定量分析，紫外检测波长为260nm。在每个操作中，将100μl样品注入含有50mm pb+100mm na2so4(ph 7.0)缓冲液的缓冲液，以0.6ml/min的流速洗脱30min。根据mrna定量的hplc的标准曲线，通过面积积分对转录体系中的mrna进行定量。
[0174]
实施例3-1和对比例1和对比例2的hplc检测谱图如图1所示，根据峰面积计算得到的相对mrna产量如图2所示。
[0175]
结果表明：在转录体系中加入磺酸基配基修饰的琼脂糖微球固相介质增加了mrna的产量，而加入无配基的琼脂糖微球对mrna的产量无显著性影响。
[0176]
实施例14(测试例3)
[0177]
对实施例3-1和对比例1和对比例2进行琼脂糖凝胶电泳测试，测试方法为：制备浓度为1.5％的琼脂糖凝胶，取3μl转录后的样品加入7μl无菌无酶水以及2μl的6x的rna loading buffer混合，65℃加热5min后，立即冰浴上样10μl，进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图3所示。
[0178]
结果表明：在转录体系中加入磺酸基配基修饰的琼脂糖微球固相介质增加了mrna的产量，而加入无配基的琼脂糖微球对mrna的产量无显著性影响。
[0179]
实施例15(测试例4)
[0180]
对实施例3-1和对比例1和对比例2进行dsrna产量分析，测试方法为：dotblot法:将转录得到的mrna稀释到50ng/μl。取各样品2μl滴在nylon膜上，风干之后，用封闭液(5％脱脂奶粉)封闭1h。取出封闭液，用tbst缓冲液清洗3次(10min/次)；加入一抗室温孵育1h后，取出一抗，用tbst缓冲液清洗3次(10min/次)；加入二抗，室温孵育1h后，取出二抗，加入tbst缓冲液清洗3次(10min/次)。tcl发光液a、b按1:1混合，取100μl均匀滴在膜上通过凝胶成像仪拍照。结果如图4所示。
[0181]
结果表明：在体外转录过程中加入磺酸基配基修饰的琼脂糖微球固相介质可以显著性减少dsrna的产生，而加入无配基的琼脂糖微球对dsrna的产生无显著性影响。
[0182]
实施例16
[0183]
本实施例16为对比例1、对比例2和实施例3-1转录体系中mrna稳定性比较。与对比例1、对比例2和实施例3-1的区别在于，转录完成之后室温放置12h，测定剩余的完整mrna含量，并与转录完成后的含量进行对比。
[0184]
表11为实施例16中各个样品(对比例1、对比例2和实施例3-1)室温放置12h后剩余的mrna含量与各自转录完成后的含量进行的对比(相对剩余含量％)，三个样品分别以“对比例1-12h”、“对比例2-12h”和“实施例3-1-12h”表示。
[0185]
表11
[0186][0187][0188]
结果表明：在放置12h后，体外转录体系和加入无配基修饰琼脂糖微球的的转录体系中的mrna发生显著降解，加入磺酸基修饰的琼脂糖微球的转录体系中的mrna几乎无降解。因此，在体外转录体系中加入磺酸基修饰的琼脂糖微球可以显著提升mrna的稳定性。
[0189]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸形成的mrna高产制备方法，其特征在于，所述制备方法是在转录过程中加入固相介质。2.根据权利要求1所述的mrna高产制备方法，其特征在于，所述固相介质为修饰有带负电荷基团的介质。3.根据权利要求2所述的mrna高产制备方法，其特征在于，所述固相介质上修饰的负电荷基团为磺酸基、甲基磺酸基、乙基磺酸基、丙基磺酸基、磷酸基、羧酸基、甲酸基、羟基、聚腺苷酸、聚胸苷酸、聚尿苷酸、聚鸟苷酸和聚胞苷酸中的一种或多种。4.根据权利要求1-3任一所述的mrna高产制备方法，其特征在于，所述固相介质的形态为颗粒状、膜状和片状中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的mrna高产制备方法，其特征在于，所述颗粒状固相介质包括微球和纳米颗粒中的一种或多种；所述颗粒状固相介质的材质包括有机材料、无机材料和功能性材料中的一种或多种；所述有机材料包括天然多糖类和合成高聚物中的一种或多种；所述天然多糖类有机材料包括纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖和魔芋葡甘聚糖中的一种或多种；所述合成聚合物包括苯乙烯类聚合物，丙烯酸类聚合物和聚乙烯酸类聚合物中的一种或多种；所述无机材料包括硅胶、玻璃、金属氧化物和羟基磷灰石中的一种或多种；所述功能性材料包括磁性材料和热敏性材料中的一种或多种；所述膜状固相介质包括硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维素膜中的一种或多种；所述片状固相介质包括碳纳米管。6.根据权利要求5所述的mrna高产制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.固相介质预处理：将固相介质用无菌无酶水清洗之后，用缓冲液平衡；s2.配制mrna体外转录体系，并将固相介质加入转录体系混合物中，进行转录反应制备mrna；s3.转录完成之后，采用离心或者重力沉降方法收集上清，获得mrna溶液。7.根据权利要求6所述的mrna高产制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，预处理是将固相介质用无菌无酶水清洗之后，再以缓冲液平衡，震荡平衡后抽干；所述缓冲液包括tris-hcl缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和hepes缓冲液中的一种或多种；所述震荡平衡时间为5-240min。8.根据权利要求6所述的mrna高产制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，固相介质的加入转录体系混合物的时机为转录起始阶段、转录过程阶段或转录后阶段，优选为转录起始阶段；固相介质的加入量为1-1000mg/ml，优选为10-200mg/ml。9.根据权利要求8所述的mrna高产制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，转录体系混合物包括反应缓冲液、dna模板、ntp、t7聚合酶、rnase a抑制剂和焦磷酸酶；转录反应温度为20-60℃。10.根据权利要求6所述的mrna高产制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，离心转速为8000-12000rpm/min，优选为10000rpm/min；离心时间为1-3min，优选为2min。

技术总结
本发明提供了一种在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸形成的mRNA高产制备方法，所述制备方法是在转录过程中加入固相介质。与现有技术相对比，本发明具有以下优点：本发明所提供的在体外转录过程中减少或抑制双链核糖核酸形成的mRNA高产制备方法，在体外转录中加入不同种类带负电荷的固相介质，通过界面调控，减少了dsRNA的产生，同时提升了mRNA的产量和稳定性。此方法采用的固相介质不溶于水，不会污染转录体系；在转录完成之后固相介质易分离，操作简单；固相介质经适当处理后可以重复使用，成本低廉，易于放大到工业化规模生产中。易于放大到工业化规模生产中。易于放大到工业化规模生产中。


技术研发人员：张松平 苏志国 冯雪 李正军 马艳艳
受保护的技术使用者：中国科学院过程工程研究所
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/8/4