一种高配基密度金属螯合亲和层析介质及其制备方法

1.本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种高配基密度金属螯合亲和层析介质及其制备方法。


背景技术：

2.以标签蛋白为媒介分离纯化蛋白质的方法被广泛用于生物研究。标签蛋白是与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，这些标签与目的蛋白质融合，通过亲和层析加速蛋白质分离纯化。
3.金属螯合亲和层析法(imac)就是一种常用的蛋白纯化方法。imac的原理是基于过渡金属离子(fe
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、co
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、ni
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、cu
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、zn
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)与蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等发生特殊的相互作用，形成稳定的螯合物从而进行分离，该法可实现组氨酸标签蛋白的快速高效纯化分离，产率高达95％。由于金属螯合亲和层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，已成为重组蛋白分离纯化的一个重要工具。
4.目前制备的金属螯合亲和层析介质普遍存在配基密度不高、金属离子泄露等问题，从而导致后续蛋白分离时层析介质蛋白载量低、使用寿命短以及蛋白污染。活化剂的选择在生物层析介质的制备过程中至关重要。首先活化剂应当不会造成基质的结构破坏，其次活化剂影响了后续基质偶联配基的数量，作为一个联结链，活化剂还影响了配基与基质结合的牢固程度。常用的活化剂主要有环氧氯丙烷和烯丙基缩水甘油醚(age)两种。环氧氯丙烷常温下即可与基质发生反应，但容易水解，且两端基团均可与基质反应，因此反应温度过高以及时间过久，容易造成琼脂糖微球交联，后续引入配基密度低下；age与基质反应需在较高温度下进行，反应时间长且反应活性差，但几乎不存在副反应，反应后活化位点多。专利cn101007265a以一种晶胶作为基质，在其内表面固载ni
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亲和配基用于牛血清蛋白(bsa)的分离纯化，蛋白载量仅为2～6mg/ml介质。专利cn107754767a以烯丙基缩水甘油醚作为活化剂，配基密度较低，存在可提升空间。因此，选择合适的活化剂，并对基质表面基团进行合理改性是提高其蛋白载量的关键。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了一种高配基密度金属螯合亲和层析介质及其制备方法。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.一种高配基密度金属螯合亲和层析介质，在琼脂糖孔道表面引入带有卤素原子的烯烃，其制备方法为：以琼脂糖微球为基质，在琼脂糖孔道表面引入一种高活性活化剂，并在活化位点上接枝葡聚糖分子，经过二次活化后偶联螯合剂，最后螯合相应金属离子得到最终产品。
8.高配基密度金属螯合亲和层析介质的制备方法，包括如下步骤：
9.i)接枝葡聚糖分子
10.将一定量的琼脂糖微球分散于去离子水中，加入naoh溶液(含nabh4)和na2so4，在30～60℃下充分搅拌反应1～2h，加入活化剂，保温反应12～24h，经溴水活化后水洗得到活化的琼脂糖微球。
11.将微球重新分散于去离子水中，加入一定浓度特定分子量的葡聚糖溶液，在室温下充分搅拌反应1～2h，加入naoh溶液(含nabh4)，反应12～24h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。
12.ii)偶联螯合剂
13.将得到的微球按照步骤i)继续活化，分散于去离子水中，加入一定量螯合剂和na2co3溶液(含nabh4)，在40～80℃下充分搅拌反应12～24h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
14.iii)螯合金属离子
15.将上述的微球分散于去离子水中，加入一定量金属盐溶液，室温充分搅拌反应4～8h得到最终产品。
16.进一步，步骤i中琼脂糖微球可以为琼脂糖微球4b、6b、4ff、6ff中的一种，优选为琼脂糖微球4ff、6ff。
17.进一步，步骤i中活化剂可以为3-溴-1-丙烯、4-氯-1-丁烯、4-溴-1-丁烯中的一种，优选为4-氯-1-丁烯。
18.进一步，步骤i中活化剂与琼脂糖微球的体积比为1:(2～10)，优选为1:(3～6)。
19.进一步，步骤i中葡聚糖溶液的浓度为100～800g/l，优选为300～600g/l。
20.进一步，步骤i中葡聚糖的分子量为10000～200000，优选为20000-100000。
21.进一步，步骤步骤ii中所述螯合剂可以为亚氨基二乙酸、亚硝基三乙酸、n,n,n'-3-羧甲基乙二胺、羧甲基门冬氨酸、四乙烯戊胺中的一种，优选为亚氨基二乙酸、亚硝基三乙酸。
22.进一步，步骤iii中所述的金属可以为fe
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、co
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、ni
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、cu
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、zn
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中的一种，优选为ni
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、cu
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。
23.本发明以琼脂糖微球为基质，在琼脂糖孔道表面引入一种高活性活化剂，并在活化位点上接枝特定分子量的葡聚糖分子，经过二次活化后偶联螯合剂，最后螯合相应金属离子得到最终产品。该活化剂的特征为带有卤素原子的烯烃，以该法制备的金属螯合亲和层析介质配基密度以及蛋白载量高，结构稳定且无毒无害，适用于各类组氨酸(histidine)标记蛋白的分离纯化。
24.该方法是通过在琼脂糖孔道表面引入一种高活性活化剂，该活性剂的特征为带有卤素原子的烯烃。与环氧基团相比，卤元素与基质表面羟基的反应活性更高，因此反应条件更加温和，活化效率更高，配基密度变高的同时使得金属和螯合剂结合更加紧密。同时，较短的直碳链能够帮助配基与基质结合地更加牢固。聚合物接枝型层析介质是近年来兴起的具有高吸附容量和高传递速率的一种层析介质，葡聚糖接枝型层析介质为主要代表之一。在微球上接枝葡聚糖分子可实现蛋白质吸附空间由二维平面结构向三维立体结构的转变，可以提高介质的静态吸附容量、动态载量，加快蛋白质吸附速率。且葡聚糖与蛋白质存在特定的分子间作用力，这也在一定程度上加快了蛋白质在葡聚糖接枝型层析介质中的传递速度。接枝葡聚糖的微球可在一定程度上增加介质的功能基团衍生能力和结合点数目，从而
提高介质的蛋白纯化能力。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
26.(1)在制备过程中引入高效活化剂，在相对温和的反应条件下提高了反应速率，增加了活性位点，从而提高了后续配基接入量和蛋白载量，高配基密度使得金属和螯合剂结合更加紧密，短链烃使得基质和配基结合更加牢固。
27.(2)在琼脂糖微球上接枝葡聚糖分子，优化了琼脂糖微球内部空间结构，提高了介质的功能基团衍生能力和结合点数目，从而提高介质的蛋白载量。
28.(3)该方法操作简单，便于放大，制备的层析介质结构稳定，适用于各类组氨酸标记蛋白的分离纯化。
附图说明
29.图1为激光共聚焦扫描显微镜下fitc-葡聚糖接枝微球照片；
30.图2为实施例6和对比例1制备的层析介质层析图谱。
具体实施方式
31.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。以下具体实施方式中所采用的原料均购于市场。
32.除非特殊说明，室温表示为25℃。
33.实施例1
34.(1)在100ml三颈烧瓶中加入10ml琼脂糖微球4ff，分散于4ml去离子水中，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，1.25g无水na2so4。
35.在45℃下充分搅拌反应1h后，加入2.5ml 4-氯-1-丁烯，保温反应18h，去离子水洗涤微球。经测定烯丙基密度为240μmol/ml。
36.(2)将上述微球重新分散于20ml去离子水中，加入0.2g无水nah2po4，室温下搅拌。5min后加入3％溴水至溶液呈深黄色，反应15min。加入nabh4至黄色褪去，去离子水洗涤微球。
37.(3)将微球分散于10ml 300g/l葡聚糖溶液中(mw＝30000)，在室温下充分搅拌反应1h，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，反应18h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。经测定葡聚糖接枝量为13.4mg/ml。
38.(4)将得到的微球按照上述步骤继续活化一遍，分散于4ml去离子水中，加入10ml 2mol/l na2co3溶液(含nabh
4 0.04g)和2g亚氨基二乙酸，在60℃下充分搅拌反应18h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
39.(5)将上述的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 0.05mol/l乙酸镍溶液，室温充分搅拌反应6h得到最终产品。经测定ig g动态蛋白载量为43.2mg/ml。
40.实施例2
41.(1)在100ml三颈烧瓶中加入10ml琼脂糖微球6ff，分散于4ml去离子水中，加入
10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，1.25g无水na2so4。
42.在45℃下充分搅拌反应1h后，加入2.5ml 4-溴-1-丁烯，保温反应18h，去离子水洗涤微球。经测定烯丙基密度为250μmol/ml。
43.(2)将上述微球重新分散于20ml去离子水中，加入0.2g无水nah2po4，室温下搅拌。5min后加入3％溴水至溶液呈深黄色，反应15min。加入nabh4至黄色褪去，去离子水洗涤微球。
44.(3)将微球分散于10ml 500g/l葡聚糖溶液中(mw＝50000)，在室温下充分搅拌反应1h，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，反应18h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。经测定葡聚糖接枝量为15.7mg/ml。
45.(4)将得到的微球按照上述步骤继续活化一遍，分散于4ml去离子水中，加入10ml 2mol/l na2co3溶液(含nabh
4 0.04g)和2g亚硝基三乙酸，在60℃下充分搅拌反应18h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
46.(5)将上述的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 0.05mol/l乙酸铜溶液，室温充分搅拌反应6h得到最终产品。经测定ig g动态蛋白载量为47.4mg/ml。
47.实施例3
48.(1)在100ml三颈烧瓶中加入10ml琼脂糖微球4b，分散于4ml去离子水中，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，1.25g无水na2so4。在45℃下充分搅拌反应1h后，加入2.5ml 3-溴-1-丙烯，保温反应18h，去离子水洗涤微球。经测定烯丙基密度为256μmol/ml。
49.(2)将上述微球重新分散于20ml去离子水中，加入0.2g无水nah2po4，室温下搅拌。5min后加入3％溴水至溶液呈深黄色，反应15min。加入nabh4至黄色褪去，去离子水洗涤微球。
50.(3)将微球分散于10ml 600g/l葡聚糖溶液中(mw＝70000)，在室温下充分搅拌反应1h，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，反应18h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。经测定葡聚糖接枝量为17.8mg/ml。
51.(4)将得到的微球按照上述步骤继续活化一遍，分散于4ml去离子水中，加入10ml 2mol/l na2co3溶液(含nabh
4 0.04g)和2g n,n,n'-3-羧甲基乙二胺，在60℃下充分搅拌反应18h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
52.(5)将上述的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 0.05mol/l硝酸铁溶液，室温充分搅拌反应6h得到最终产品。经测定ig g动态蛋白载量为50.4mg/ml。
53.实施例4
54.(1)在100ml三颈烧瓶中加入10ml琼脂糖微球6b，分散于4ml去离子水中，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，1.25g无水na2so4。在45℃下充分搅拌反应1h后，加入2.5ml 4-氯-1-丁烯，保温反应18h，去离子水洗涤微球。经测定烯丙基密度为228μmol/ml。
55.(2)将上述微球重新分散于20ml去离子水中，加入0.2g无水nah2po4，室温下搅拌。5min后加入3％溴水至溶液呈深黄色，反应15min。加入nabh4至黄色褪去，去离子水洗涤微球。
56.(3)将微球分散于10ml 400g/l葡聚糖溶液中(mw＝100000)，在室温下充分搅拌反应1h，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，反应18h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。经测定葡聚糖接枝量为19.5mg/ml。
57.(4)将得到的微球按照上述步骤继续活化一遍，分散于4ml去离子水中，加入10ml 2mol/l na2co3溶液(含nabh
4 0.04g)和2g羧甲基门冬氨酸，在60℃下充分搅拌反应18h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
58.(5)将上述的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 0.05mol/l硝酸钴溶液，室温充分搅拌反应6h得到最终产品。经测定ig g动态蛋白载量为44.6mg/ml。
59.实施例5
60.(1)在100ml三颈烧瓶中加入10ml琼脂糖微球4ff，分散于4ml去离子水中，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，1.25g无水na2so4。在30℃下充分搅拌反应1h后，加入2.5ml 4-溴-1-丁烯，保温反应12h，去离子水洗涤微球。经测定烯丙基密度为246μmol/ml。
61.(2)将上述微球重新分散于20ml去离子水中，加入0.2g无水nah2po4，室温下搅拌。5min后加入3％溴水至溶液呈深黄色，反应15min。加入nabh4至黄色褪去，去离子水洗涤微球。
62.(3)将微球分散于10ml 700g/l葡聚糖溶液中(mw＝150000)，在室温下充分搅拌反应1h，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，反应12h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。经测定葡聚糖接枝量为20.2mg/ml。
63.(4)将得到的微球按照上述步骤继续活化一遍，分散于4ml去离子水中，加入10ml 2mol/l na2co3溶液(含nabh
4 0.04g)和2g四乙烯戊胺，在40℃下充分搅拌反应12h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
64.(5)将上述的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 0.05mol/l乙酸锌溶液，室温充分搅拌反应4h得到最终产品。经测定ig g动态蛋白载量为45.9mg/ml。
65.实施例6
66.(1)在100ml三颈烧瓶中加入10ml琼脂糖微球6ff，分散于4ml去离子水中，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，1.25g无水na2so4。
67.在60℃下充分搅拌反应2h后，加入2.5ml 3-溴-1-丙烯，保温反应24h，去离子水洗涤微球。经测定烯丙基密度为246μmol/ml。
68.(2)将上述微球重新分散于20ml去离子水中，加入0.2g无水nah2po4，室温下搅拌。5min后加入3％溴水至溶液呈深黄色，反应15min。加入nabh4至黄色褪去，去离子水洗涤微球。
69.(3)将微球分散于10ml 800g/l葡聚糖溶液中(mw＝200000)，在室温下充分搅拌反应2h，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，反应24h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。经测定葡聚糖接枝量为21.6mg/ml。
70.(4)将得到的微球按照上述步骤继续活化一遍，分散于4ml去离子水中，加入10ml 2mol/l na2co3溶液(含nabh
4 0.04g)和2g亚氨基二乙酸，在80℃下充分搅拌反应24h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
71.(5)将上述的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 0.05mol/l乙酸镍溶液，室温充分搅拌反应8h得到最终产品。经测定ig g动态蛋白载量为47.8mg/ml。
72.对比例1
73.(1)在100ml三颈烧瓶中加入10ml琼脂糖微球6ff，分散于4ml去离子水中，加入
10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，1.25g无水na2so4。
74.在60℃下充分搅拌反应2h后，加入2.5ml 3-溴-1-丙烯，保温反应24h，去离子水洗涤微球。经测定烯丙基密度为242μmol/ml。
75.(2)将上述微球重新分散于20ml去离子水中，加入0.2g无水nah2po4，室温下搅拌。5min后加入3％溴水至溶液呈深黄色，反应15min。加入nabh4至黄色褪去，去离子水洗涤微球。
76.(3)将得到的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 2mol/l na2co3溶液(含nabh
4 0.04g)和2g亚氨基二乙酸，在80℃下充分搅拌反应24h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
77.(4)将上述的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 0.05mol/l乙酸镍溶液，室温充分搅拌反应8h得到最终产品。经测定ig g动态蛋白载量为36.4mg/ml。
78.对比例2
79.(1)在100ml三颈烧瓶中加入10ml琼脂糖微球6ff，分散于4ml去离子水中，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，1.25g无水na2so4。
80.在60℃下充分搅拌反应2h后，加入2.5ml烯丙基缩水甘油醚，保温反应24h，去离子水洗涤微球。经测定烯丙基密度为180μmol/ml。
81.(2)将上述微球重新分散于20ml去离子水中，加入0.2g无水nah2po4，室温下搅拌。5min后加入3％溴水至溶液呈深黄色，反应15min。加入nabh4至黄色褪去，去离子水洗涤微球。
82.(3)将微球分散于10ml 800g/l葡聚糖溶液中(mw＝200000)，在室温下充分搅拌反应2h，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，反应24h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。经测定葡聚糖接枝量为15.7mg/ml。
83.(4)将得到的微球按照上述步骤继续活化一遍，分散于4ml去离子水中，加入10ml 2mol/l na2co3溶液(含nabh
4 0.04g)和2g亚氨基二乙酸，在80℃下充分搅拌反应24h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
84.(5)将上述的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 0.05mol/l乙酸镍溶液，室温充分搅拌反应8h得到最终产品。经测定ig g动态蛋白载量为38.2mg/ml。
85.对比例3
86.(1)在100ml三颈烧瓶中加入10ml琼脂糖微球6ff，分散于4ml去离子水中，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，1.25g无水na2so4。滴加2.5ml环氧氯丙烷，常温反应2h，去离子水洗涤微球。经测定烯丙基密度为80μmol/ml。
87.(2)将上述微球重新分散于20ml去离子水中，加入0.2g无水nah2po4，室温下搅拌。5min后加入3％溴水至溶液呈深黄色，反应15min。加入nabh4至黄色褪去，去离子水洗涤微球。
88.(3)将微球分散于10ml 800g/l葡聚糖溶液中(mw＝200000)，在室温下充分搅拌反应2h，加入10ml的1mol/l naoh溶液(含nabh
4 0.04g)，反应24h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。经测定葡聚糖接枝量为6.8mg/ml。
89.(4)将得到的微球按照上述步骤继续活化一遍，分散于4ml去离子水中，加入10ml 2mol/l na2co3溶液(含nabh
4 0.04g)和2g亚氨基二乙酸，在80℃下充分搅拌反应24h，水洗
得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。
90.(5)将上述的微球分散于4ml去离子水中，加入10ml 0.05mol/l乙酸镍溶液，室温充分搅拌反应8h得到最终产品。经测定ig g动态蛋白载量为18.6mg/ml。
91.烯丙基密度测量方法：1.称取1.0ml烯丙基活化的样品于250ml碘量瓶中，移液管量取30mlkbro3-kbr溶液(0.1m)，量取10ml 6mol/l盐酸充分要摇动下加入碘量瓶中，并迅速盖好盖子，用去离子水封口，变为棕黄色。用没有样品的碘量瓶作为空白。在暗处放置20min；2.分别迅速加入10ml 20％ki溶液，置于暗处5min；3.用0.1m的na2s2o3标准溶液滴定，分别加入一吸管1％淀粉溶液作为指示剂，滴定终点至蓝紫色消失，实验组和对照组消耗的na2s2o3标准溶液分别记作v1和v0。ρ
烯丙基
(mmol/ml)计算公式如下：
92.ρ
烯丙基
＝50*(v
0-v1)
93.葡聚糖接枝量测量方法：取两个量筒装入相同体积活化未接枝葡聚糖微球，一个进行葡聚糖接枝实验，另一个作为对照样。将两个样品放入烘箱中110℃干燥18～24h，测定的质量差即为葡聚糖接枝量。
94.动态蛋白载量测量方法：将制备的层析介质装入层析柱中(cv＝1ml),连接到bio-rad蛋白层析系统中,通入10个柱体积去离子水，待床层平稳后，经缓冲液(20mm pb+0.15m nacl,ph＝7.4)平衡系统。将单克隆抗体ig g原液稀释至c0(3.80mg/ml)，控制0.25ml/min的速度上样。首先，让样品流经空柱，在出口处得到蛋白紫外检测信号(100％)；接着经缓冲液(20mm pb+0.15mnacl,ph＝7.4)平衡系统，让样品流入装有填料的层析柱中，待流穿曲线的紫外检测信号达到10％结束上样，记录出峰体积v1(ml)。用缓冲液(20mm pb+0.15m nacl,ph＝7.4)平衡系统，经缓冲液(20mm pb+0.15m nacl+0.5m咪唑,ph＝7.4)洗脱。上样10μl 1％丙酮，记录出峰体积v0(ml)。单位蛋白动态载量q10％(mg/ml)计算公式如下：
95.
技术特征：
1.一种高配基密度金属螯合亲和层析介质，其特征为：在琼脂糖孔道表面引入带有卤素原子的烯烃，其制备方法为：以琼脂糖微球为基质，在琼脂糖孔道表面引入一种高活性活化剂，并在活化位点上接枝葡聚糖分子，经过二次活化后偶联螯合剂，最后螯合相应金属离子得到最终产品。2.权利要求1所述的高配基密度金属螯合亲和层析介质的制备方法，包括如下步骤：i)接枝葡聚糖分子将琼脂糖微球分散于去离子水中，加入含nabh4的naoh溶液和na2so4，在30～60℃下充分搅拌反应1～2h，加入活化剂，保温反应12～24h，经溴水活化后水洗得到活化的琼脂糖微球；将微球重新分散于去离子水中，加入葡聚糖溶液，在室温下充分搅拌反应1～2h，加入含nabh4的naoh溶液，反应12～24h，水洗得到葡聚糖接枝琼脂糖微球。ii)偶联螯合剂将得到的微球按照步骤i)继续活化一遍，分散于去离子水中，加入一定量螯合剂和含nabh4的na2co3溶液，在40～80℃下充分搅拌反应12～24h，水洗得到偶联螯合剂的琼脂糖微球。iii)螯合金属离子将步骤ii)的微球分散于去离子水中，加入金属盐溶液，室温充分搅拌反应4～8h得到最终产品。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中所述琼脂糖微球为琼脂糖微球4b、6b、4ff、6ff中的一种。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中所述活化剂为3-溴-1-丙烯、4-溴-1-丁烯、4-氯-1-丁烯中的一种。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中活化剂与琼脂糖微球的体积比为1:(2～10)。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中活化剂与琼脂糖微球的体积比为1:(3～6)。7.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于：步骤i)中葡聚糖溶液的浓度为100～800g/l；葡聚糖的分子量为10000～200000。8.根据权利要求7所述的的制备方法，其特征在于：步骤i)中葡聚糖溶液的浓度为300～600g/l；葡聚糖的分子量为20000-100000。9.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于：步骤ii)中所述螯合剂为亚氨基二乙酸、亚硝基三乙酸、n,n,n'-3-羧甲基乙二胺、羧甲基门冬氨酸、四乙烯戊胺中的一种。10.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于：步骤iii)中所述的金属离子为fe2+、co2+、ni2+、cu2+、zn2+中的一种。

技术总结
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种高配基密度金属螯合亲和层析介质及其制备方法。一种高配基密度金属螯合亲和层析介质，在琼脂糖孔道表面引入带有卤素原子的烯烃，其制备方法为：以琼脂糖微球为基质，在琼脂糖孔道表面引入一种高活性活化剂，并在活化位点上接枝葡聚糖分子，经过二次活化后偶联螯合剂，最后螯合相应金属离子得到最终产品。本发明在制备过程中引入高效活化剂，在相对温和的反应条件下提高了反应速率，增加了活性位点，从而提高了后续配基接入量和蛋白载量，高配基密度使得金属和螯合剂结合更加紧密，短链烃使得基质和配基结合更加牢固。基结合更加牢固。基结合更加牢固。


技术研发人员：徐偲 金子杰 戴立言 王晓钟 陈英奇
受保护的技术使用者：浙江大学衢州研究院
技术研发日：2023.04.25
技术公布日：2023/8/4