用于制备覆盆子酮的方法与流程

1.本发明涉及一种用于制备天然覆盆子酮的方法。


背景技术：

2.覆盆子酮或4-(4-羟基苯基)-2-丁酮是覆盆子中的主要芳香族化合物，但也存在于蔓越莓或黑莓中。
3.覆盆子酮用于香水、化妆品或农业食品工业，以产生水果气味。
4.这种天然芳香族化合物可按照每千克覆盆子1-4mg的比率从水果中提取。考虑到这种芳香族化合物在水果中的丰度非常低，已经开发了合成方法，特别是：
[0005]-如fr 1227595中所述，在丁烯酮的存在下通过苯酚的烷基化；
[0006]-如de 2145308、cn 104355977或cn 104496778中所述，在4-羟基-2-丁酮的存在下通过苯酚的缩合。4-羟基-2-丁酮通过丙酮和甲醛的缩合制备；
[0007]-如fr 2221433中所述，在2-乙酰基-2-羟基甲基乙基乙酸酯的存在下通过苯酚的缩合制备。化合物2-乙酰基-2-羟基甲基乙基乙酸酯由甲醛和乙酰乙酸乙酯制备；
[0008]-如jp 01242549中所述，通过苯酚与1,3-二氯-2-丁烯的缩合制备；或
[0009]-如cn 104193607中所述，在氢溴酸的存在通过茴香酮的脱甲基化制备。
[0010]
据发明人所知，仅存在合成方法以试图弥补天然覆盆子酮的低丰度。然而，与天然来源的调味剂相比，合成调味剂不太受消费者欢迎。
[0011]
本发明涉及通过新路线以良好的产率和高特异性制造天然覆盆子酮。


技术实现要素：

[0012]
本发明的第一主题涉及一种用于制备天然覆盆子酮的方法，所述方法包括：
[0013]-步骤(a)，对香豆酸的生物转化，以允许制备对羟基苯甲醛，
[0014]-步骤(b)，其中使步骤(a)结束时获得的对羟基苯甲醛与丙酮缩合，以允许形成对羟基亚苄基丙酮，
[0015]-步骤(c)，其中通过生物转化或生物催化将步骤(b)结束时获得的对羟基亚苄基丙酮转化为覆盆子酮。
[0016]
本发明的另一主题涉及一种天然覆盆子酮，其可通过本发明的方法获得。
[0017]
本发明还涉及根据本发明的天然覆盆子酮作为调味剂或香料的用途。
[0018]
最后，本发明涉及一种组合物，其包含根据本发明的天然覆盆子酮，优选选自由以下组成的组：食品产品、饮料、化妆品配制品、药物配制品和香料。
具体实施方式
[0019]
在本发明的上下文中，并且除非另有说明，否则表述“在
……
与
……
之间”包括极限值。在本发明的上下文中，除非另有说明，否则术语“包含
……”
意指“由
……
构成”。除非另有说明，否则百分比和ppm是按质量计的百分比和ppm。
[0020]
在本发明的上下文中，并且除非另有说明，否则术语“ppm”意指“百万分率”。该单位表示质量分数：1ppm＝1mg/kg。
[0021]
根据本发明并且通过本发明的方法获得的天然覆盆子酮是一种根据欧盟(ec)规章1334/2008第9.2.c)条的天然调味物质。即从植物、动物或微生物来源的材料通过物理方法、酶方法或微生物方法获得的调味物质，所述材料是原样获得的，或者是经过一种或多种制备食品的常规方法加工用于人类消费之后获得的。天然调味物质对应于天然存在的并且在自然界中已被鉴定的物质。
[0022]
在本发明的上下文中，并且除非另有说明，否则术语“发酵”意指涉及微生物的微生物方法。通常，该反应在发酵罐中在微生物培养基中进行。
[0023]
在本发明的上下文中，术语“发酵”是指包括以下的方法：生长步骤，其中将微生物放置在有利于其生长的培养基中，随后是生物转化步骤，其中在待转化的底物的存在下放置所述微生物；优选地，微生物是细菌或酵母。
[0024]
在本发明的上下文中，并且除非另有说明，否则术语“生物催化”是指其中通过酶催化转化底物的工艺步骤。
[0025]
本发明的第一主题涉及一种用于制备天然覆盆子酮的方法，所述方法包括：
[0026]-步骤(a)，对香豆酸的生物转化，以允许制备对羟基苯甲醛，
[0027]-步骤(b)，其中使步骤(a)结束时获得的对羟基苯甲醛与丙酮缩合，以允许形成对羟基亚苄基丙酮，
[0028]-步骤(c)，其中通过生物转化或生物催化将步骤(b)结束时获得的对羟基亚苄基丙酮转化为覆盆子酮。
[0029]
步骤(a):
[0030]
用于制备覆盆子酮的方法包括根据以下方案进行步骤(a)的对香豆酸的生物转化，以允许制备对羟基苯甲醛：
[0031][0032]
步骤(a)是生物转化步骤：优选地，步骤(a)是微生物方法。通常，生物转化反应是在微生物的存在下通过发酵进行的。优选地，微生物选自属于放线菌目(actinomycetales)的细菌，优选属于链霉菌科(streptomycetaceae)、假诺卡氏科(pseudonocardiaceae)的细菌，非常优选地西唐氏链霉菌(streptomyces setonii)、拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)、沙链霉菌(streptomyces psammoticus)。优选地，生物转化反应是在以编号atcc 39116、dsmz 9991、dsmz 9992、cctcc 2015329或imi 390106可获得的菌株的存在下进行的。
[0033]
独立于覆盆子酮的制备方法，步骤(a)中使用的细菌是预培养的。细菌的培养通常是在营养元素的存在下在水性培养基中进行的。通常，培养基包含碳源(优选葡萄糖)、有机或无机氮源、无机盐和生长因子。碳源的浓度通常在5与50g.l-1
之间、优选在20与34g.l-1
之间。氮源(如酵母提取物)和生长因子通常以在2与20g.l-1
之间、优选在5与10g.l-1
之间的浓
度添加。此外，镁离子(如硫酸镁)可以以在0.1与5g.l-1
之间、优选在0.5与1g.l-1
之间的浓度添加。温度通常在25℃与50℃之间、优选在28℃与45℃之间。培养物的ph在7与9之间。
[0034]
培养期通常持续在5小时与40小时之间。培养期通常持续到碳源(通常是葡萄糖)几乎完全消耗，优选地使得碳源浓度小于或等于1g.l-1
。
[0035]
然后调节培养基的ph。优选地，将ph调节至大于或等于8的值。优选地，ph小于或等于11、优选小于或等于10。
[0036]
然后，将对香豆酸添加到在该预培养步骤期间获得的培养基中。培养基中对香豆酸的浓度通常在5g.l-1
与50g.l-1
之间。对香豆酸的添加可以一次性进行。也可分几部分添加对香豆酸。对香豆酸可以单独添加或作为水性介质中的溶液添加，优选以在5与40g.l-1
之间、优选在15与30g.l-1
之间的浓度。步骤(a)的温度通常在25℃与50℃之间、优选在28℃与45℃之间。
[0037]
发酵罐中的孵育时间通常在5小时与50小时之间、优选在15小时与25小时之间。发酵罐中的ph通常在7与9之间。对香豆酸被消耗，并且在培养基中获得对羟基苯甲醛。
[0038]
其他反应副产物也可以在发酵培养基中获得，如对羟基苯甲酸或对羟基苯甲醇。
[0039]
在生物转化步骤(a)结束时，通过本领域技术人员已知的任何方法，从生物质中去除后回收对羟基苯甲醛。对羟基苯甲醛可以不经进一步纯化而用于步骤(b)，或者可以在用于步骤(b)之前通过本领域技术人员已知的任何方法纯化。
[0040]
根据特定的实施例，步骤(b)可以在不进行中间体纯化的情况下进行；在步骤(a)结束时获得的对羟基苯甲醛可以直接经受步骤(b)的条件。出人意料地，来自步骤(a)的杂质或副产物对步骤(b)的转化结果几乎没有影响或没有影响。
[0041]
可替代地，步骤(b)可以在来自步骤(a)的生物质的存在下进行。
[0042]
步骤(b):
[0043]
用于制备覆盆子酮的方法包括根据以下方案进行步骤(b)的对羟基苯甲醛与丙酮的缩合：
[0044][0045]
根据一个方面，缩合步骤(b)在生物催化剂(优选白蛋白)的存在下进行，并且更具体地在牛血清白蛋白(bsa)的存在下进行。
[0046]
优选地，反应在丙酮中进行。通常，丙酮相对于对羟基苯甲醛的量过量使用。反应可以在另一种溶剂的存在下进行，所述溶剂选自水、缓冲水性介质(优选ph为8)、乙醇、正辛烷或乙酸乙酯，优选选自水、缓冲水性介质(优选ph为8)、乙醇或乙酸乙酯。根据有利的方面，溶剂选自与化妆品或食品应用相容的溶剂。
[0047]
反应通常在碱的存在下进行，所述碱优选选自咪唑、脯氨酸、l-组氨酸或盐酸胍。
[0048]
步骤(b)的温度通常在30℃与40℃之间。通常，步骤(b)在大气压下进行。通常，步骤(b)在搅拌下进行，优选以在100与500rpm之间、优选在150与300rpm之间并且非常优选在180与200rpm之间的速度进行。步骤(b)的孵育时间通常在24小时与96小时之间。
[0049]
根据另一方面，步骤(b)可以在氨基酸的存在下进行，优选l系列的氨基酸，优选选自脯氨酸、氮杂环丁烷-2-羧酸、哌啶-2-羧酸、4-羟基吡咯烷-2-羧酸、吡咯烷-2-甲酰胺、噻唑烷-4-羧酸和4-乙酰氧基吡咯烷-2-羧酸。氨基酸的量通常在15体积％与40体积％之间。溶剂通常是dmso和丙酮的混合物或乙醇和水的混合物。根据有利的方面，溶剂选自与化妆品或食品应用相容的溶剂。
[0050]
这些条件特别是在j.am.chem.soc.[美国化学学会期刊]2000,122(10),2395中描述。然而，与所述文献中描述的相反，该反应允许主要形成α,β-不饱和酮。
[0051]
对羟基亚苄基丙酮可以不经进一步纯化而用于步骤(c)，或者可以在用于步骤(c)之前通过本领域技术人员已知的任何方法纯化。
[0052]
根据特定的实施例，步骤(c)可以在不进行中间体纯化的情况下进行；在步骤(b)结束时获得的对羟基亚苄基丙酮可以直接经受步骤(c)的条件。出人意料地，来自步骤(b)和/或步骤(a)的杂质或副产物对步骤(c)的转化结果几乎没有影响或没有影响。
[0053]
步骤(c)：
[0054]
用于制备覆盆子酮的方法包括根据以下方案进行步骤(c)，其中对羟基亚苄基丙酮被氢化：
[0055][0056]
根据一个方面，步骤(c)通过生物催化进行。
[0057]
根据一个方面，步骤(c)在至少一种酶的存在下进行；优选地，酶是烯-还原酶或烯酮-还原酶。步骤(c)也可在酵母、特别是面包酵母的存在下进行。通常，步骤(c)在适合于将对羟基亚苄基丙酮转化为覆盆子酮的反应条件下进行。
[0058]
通常，步骤(c)可以在辅因子的存在下进行。再生辅因子的方法可以与所
[0059]
述辅因子组合使用。作为示例，步骤(c)中的还原可以通过从nadph中产生nadp+来进行，并且因此可以使用能够再生nadph的任何体系。
[0060]
能够再生可以使用的辅助因子的体系的实例是葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸盐和甲酸盐脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸盐和葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶、仲醇和酮脱氢酶、亚磷酸盐和亚磷酸盐脱氢酶、分子氢和氢化酶、黄素腺嘌呤二核苷酸fad/fadh2。这些体系可以与nadp+/nadph或nad+/nadh作为辅因子一起使用。
[0061]
根据另一方面，步骤(c)在微生物的存在下通过发酵来进行。微生物可以选自属于放线菌目的细菌，优选属于链霉菌科、假诺卡氏科的细菌，非常优选地西唐氏链霉菌、拟无枝酸菌、沙链霉菌。优选地，生物转化反应是在以编号atcc 39116、dsmz 9991、dsmz 9992、cctcc 2015329或imi 390106可获得的菌株的存在下进行的。微生物还可以选自属于酵母(saccharomyces group)或假丝酵母(candida)群的酵母，优选选自酿酒酵母
(saccharomyces cerevisiae)和解脂假丝酵母(candida lipolytica)。优选地，反应是在以编号atcc 7754或atcc 8661可获得的菌株的存在下进行的。步骤(c)中使用的微生物允许选择性地还原碳-碳双键而不还原碳-氧双键。
[0062]
步骤(c)通常在溶剂中进行，所述溶剂优选选自由以下组成的组：水、有机溶剂和离子液体。优选地，有机溶剂选自由以下组成的组：乙酸乙酯、乙酸丁酯、1-辛醇、庚烷、辛烷、甲基-叔丁基醚(mtbe)、乙醇和dmso。根据有利的方面，溶剂选自与化妆品或食品应用相容的溶剂。根据一个特定方面，溶剂可以是包含水和另一种溶剂的混合物的水性溶剂。水性溶剂可以是缓冲的或未缓冲的。通常，步骤(c)在小于或等于10、优选小于或等于9、更优选小于或等于8的ph下进行。通常，步骤(c)在大于或等于5、优选大于或等于6、更优选大于或等于7的ph下进行。在反应过程中，ph可能发生变化；可以通过添加碱或酸将ph保持在选定值。还可以用缓冲溶液控制ph。
[0063]
添加试剂的顺序不是特别关键。可以将试剂一起或分别添加到选定溶剂中。举例来说，辅因子再生体系、辅因子、烯-还原酶或烯酮-还原酶可以首先添加到溶剂中。
[0064]
步骤(c)通常在15℃与75℃之间、优选在20℃与55℃之间、甚至更优选在20℃与45℃之间的温度下进行。反应也可以在环境温度下进行。环境温度通常在19℃与26℃之间。
[0065]
通常，步骤(c)在搅拌下进行，优选以在100与500rpm之间、优选在150与300rpm之间并且非常优选在180与200rpm之间的速度进行。步骤(c)的孵育时间通常在24小时与96小时之间。
[0066]
根据特定方面，用于步骤(c)的酶可以是酶，如biorxiv 202341中所述的酶；doi:https://doi.org/10.1101/202341。
[0067]
根据特定方面，用于步骤(c)的酶可以是如wo 2010/075574中所述的酶。
[0068]
有利地，步骤(c)中使用的酶或微生物能够特异性还原碳-碳双键以获得酮的形成。有利地，步骤(c)中使用的酶使得能够以相对于杜鹃醇(frambinol)占优势的方式获得覆盆子酮。衍生物杜鹃醇对应于以下结构，其中酮官能团被还原成醇官能团。
[0069][0070]
本领域技术人员众所周知的是，风味物质的感官特性可能取决于某些杂质的存在和量。这就是为什么制造方法对最终化合物的味道至关重要的原因。有利地，发现本发明的覆盆子酮具有令人满意的感官特性。应当指出，本发明的覆盆子酮的感官特征曲线与从水果中提取的覆盆子酮的感官特征曲线相同。
[0071]
有利地，本发明的方法能够以良好的产率特异地生产天然覆盆子酮。
[0072]
根据另一方面，本发明包括根据本发明的覆盆子酮或根据本发明的方法获得的覆盆子酮作为调味剂或香料的用途。
[0073]
最后，本发明还包括一种组合物，其包含根据本发明的覆盆子酮，优选选自由以下组成的组：食品产品、饮料、化妆品配制品、药物配制品和香料。
[0074]
实例
[0075]
实例1：对羟基苯甲醛的制备
[0076]
1.预培养和培养
[0077]
制备适用于atcc 39116的预培养基和培养基，其包含kh2po4、na2hpo4·
12h2o、mgso4·
7h2o、酵母提取物、葡萄糖和消泡剂。预培养在170rpm和37℃下进行。培养在37℃下在搅拌下进行。
[0078]
2.生物转化
[0079]
将培养基的ph调节至8.4并且引入香豆酸溶液以获得在5与50g/l之间的最终浓度。将反应介质在37℃和170rpm下保持24小时。在生物转化24小时后，通过离心去除生物质，并滤出上清液并且通过hplc进行分析。得到4-羟基苯甲醛，产率在60％与99％之间。
[0080]
实例2：亚苄基丙酮的制备
[0081]
将对羟基苯甲醛、丙酮、溶剂、碱和bsa混合在一起。将反应介质在30℃与40℃之间的温度下并且在200rpm下孵育24至96小时。反应通过hplc监测。获得转化度大于或等于90％的亚苄基丙酮。
[0082]
实例3a：通过生物催化制备覆盆子酮
[0083]
将实例2中获得的亚苄基丙酮、溶剂、gdh、葡萄糖、nadp+、kh2po4(ph7)和烯-还原酶混合在一起。将混合物在30℃下在搅拌下孵育24小时。通过hplc分析培养基。
[0084]
获得覆盆子酮。底物转化度＝100％
[0085]
选择性：c＝c双键的100％减少
[0086]
实例3b：通过生物转化制备覆盆子酮
[0087]
1.预培养
[0088]
制备适用于下表所示的微生物1和2的预培养基，其包含葡萄糖、蛋白胨和麦芽提取物。然后将微生物1至3直接添加到预培养基中。培养在30℃下在搅拌(200rpm)下进行24小时。
[0089]
根据上述实例1制备适用于3号微生物的预培养物和培养基。
[0090]
参照菌株1解脂假丝酵母atcc 86612酿酒酵母atcc 77543拟无枝酸菌atcc 39116
[0091]
2.生物转化
[0092]
将根据实例2获得的亚苄基丙酮混合到如上所述生长期后获得的各培养基中。将混合物在30℃下在搅拌(200rpm)下孵育48小时(参比1至2)或72小时(参比3)。
[0093]
在生物转化48小时或72小时后，通过离心去除生物质，并滤出上清液并且通过hplc进行分析。获得覆盆子酮。

技术特征：
1.一种用于制备天然覆盆子酮的方法，所述方法包括：-步骤(a)，对香豆酸的生物转化，以允许制备对羟基苯甲醛，-步骤(b)，其中使步骤(a)结束时获得的所述对羟基苯甲醛与丙酮缩合，以允许形成对羟基亚苄基丙酮，-步骤(c)，其中通过生物转化或生物催化将步骤(b)结束时获得的所述对羟基亚苄基丙酮转化为覆盆子酮。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)和/或步骤(c)是微生物方法。3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中，所述生物转化反应在微生物的存在下通过发酵来进行，所述微生物优选选自属于放线菌目的细菌，优选属于链霉菌科、假诺卡氏科的细菌，非常优选西唐氏链霉菌、拟无枝酸菌、沙链霉菌，所述生物转化反应非常优选在以编号atcc 39116、dsmz 9991、dsmz 9992、cctcc 2015329或imi 390106可获得的菌株的存在下进行。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，缩合步骤(b)在生物催化剂、优选白蛋白的存在下进行，并且更具体地在牛血清白蛋白(bsa)的存在下进行。5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，步骤(b)在氨基酸的存在下进行。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，步骤(c)在烯-还原酶或烯酮-还原酶的存在下进行。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，步骤(c)在辅因子的存在下进行。8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，步骤(c)在酵母的存在下进行，所述酵母属于酵母或假丝酵母群，优选选自酿酒酵母和解脂假丝酵母。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)结束时获得的所述对羟基苯甲醛不经进一步纯化而用于步骤(b)。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)结束时获得的所述对羟基亚苄基丙酮不经进一步纯化而用于步骤(c)。

技术总结
本发明涉及一种用于制备天然覆盆子酮的方法，所述方法包括：-步骤(a)，对香豆酸的生物转化，以允许制备对羟基苯甲醛；-步骤(b)，其中使步骤(a)结束时获得的对羟基苯甲醛与丙酮缩合，以允许形成对羟基亚苄基丙酮；-步骤(c)，其中通过生物转化或生物催化将步骤(b)结束时获得的对羟基亚苄基丙酮转化为覆盆子酮。得的对羟基亚苄基丙酮转化为覆盆子酮。


技术研发人员：丹布林 M
受保护的技术使用者：罗地亚经营管理公司
技术研发日：2021.12.14
技术公布日：2023/8/6