用于评估肾移植受者排斥风险的组合标志物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及用于评估肾移植受者排斥风险的组合标志物及其应用。


背景技术：

2.目前，肾移植已成为公认的治疗终末期肾脏疾病的有效手段，我国已经成为仅次于美国的第二大肾移植开展国，我国的肾脏移植技术发展以提高移植后患者的长期生存率和生存质量为重心。肾移植术后1年生存率约为95％-97％，5年生存率约为78％～80％，10年生存率约为60％。尽管如此，排斥反应仍然是影响移植肾长期存活的首要独立危险因素，是亟待解决的瓶颈问题。
3.移植物功能延迟恢复(dgf)是肾移植术后最常见的早期并发症，是移植肾早期急性肾损伤(aki)的一种表现，增加移植物免疫原性及急性排斥反应发生的风险。临床上约10％～40％的肾移植受者术后会发生dgf，美国器官共享联合网络的研究显示，未发生dgf的肾移植受者术后6个月内急性排斥反应发生率为25％；而发生dgf者为40％，且术后6个月内的死亡率明显增加，移植肾的半数存活期由11.5年降到7.2年。国内学者也经过大样本量的总结，认为dgf对移植患者总体长期人肾存活有最明显的负面影响。因此，术后预测dgf发生有利于早期评估肾移植排斥反应风险，有利于临床的早期鉴别诊断与治疗。
4.然而目前临床上检测肾移植排斥的方法还只限于根据临床表现如体温升高，血压异常，血清肌酐升高等来判定。但这些方法不能早期诊断排斥反应，往往是一旦上述症状出现，移植肾排斥已经发生并已进入严重阶段，临床上很难救治；其次是这些诊断指标缺乏特异性，因为人体其它部位出现感染时，也会诱发上述临床症候和血肌酐升高，会因此而误判危及患者生命。移植肾穿刺活检是目前临床上唯一的权威诊断方法，但这种方法的最大缺点是其对移植器官的创伤性，有可能造成肾脏出血、肾周血肿、动静脉痿等并发症，危害移植肾的存活。所以目前临床上急需建立一种快捷、敏感、特异和无创的检测方法对肾脏移植后免疫排斥反应进行风险监测。这对于早期发现排斥反应以及指导临床医生合理调整免疫抑制剂用量，提高病人生存质量，降低移植患者的死亡率，延长移植肾的存活时间均具有重要意义。
5.肾脏是人体泌尿系统中最重要的器官，尿液代谢物的改变在第一时间反应肾脏的状态，研究肾移植术后早期是否发生dgf两组间尿液代谢物在理论上是可行的。通过液体活检技术从尿液代谢物中寻找组合生物标志物为评估肾移植术后排斥反应风险提供了窗口，为进一步指导临床诊治提供依据。


技术实现要素：

6.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种评估肾移植受者排斥风险的组合标志物及其应用。
7.技术方案：第一方面，本发明提供了一种用于评估肾移植受者排斥风险的组合标
志物，所述组合标志物包括：乙酸aceticacid、柠檬酸citricacid、乙基丙二酸ethylmalonicacid、戊二酸glutaricacid、l-色氨酸l-tryptophan、乳酸lacticacid、肌醇myo-inositol、异嘌呤醇oxypurinol、苯丙酮酸phenylpyruvicacid、2-氧代异己酸2-oxoisocaproicacid、3-羟基戊二酸3-hydroxyglutaricacid、3-羟基异戊酸3-hydroxyisovalericacid。
8.本发明提供了上述组合标志物在肾移植受者排斥风险评估试剂盒中的应用。
9.第二方面，本发明提供了一种肾移植受者排斥风险评估的试剂盒，所述试剂盒包括所述组合标志物的检测试剂。
10.进一步的，上述试剂盒还包括数据处理系统，所述数据处理系统能够将组合标志物的核磁检测数值通过以下公式转化为待测肾移植受者的排斥风险预测分数值risk score，并用于判断待测者是否为排斥反应高风险肾移植受者：
11.所述待测者的risk score计算方法为：risk score＝1/(1+e^(-(0.020403510*乙酸-0.000598003*柠檬酸-0.104102733*乙基丙二酸-0.007513717*戊二酸-0.001076258*l-色氨酸+0.004224403*乳酸+0.005415062*肌醇+0.106476174*异嘌呤醇-0.003641094*苯丙酮酸+0.011974537*2-氧代异己酸-0.022673673*3-羟基戊二酸-0.104147022*3-羟基异戊酸-0.713367476)))。
12.判断方法为：如果risk score≥阈值，则待测者为肾移植排斥反应高风险受者，如果risk score＜阈值，则待测者为肾移植排斥反应低风险受者。
13.所述阈值通过受试者工作特征曲线确定，具体方法为：构建训练集，训练集由n例dgf患者和m例非dgf者组成，n和m均为自然数；获得训练集中所有患者的risk score，根据灵敏度和特异性制作受试者工作特征曲线，当受试者工作特征曲线上灵敏度与特异性之和最大时，此时risk score的值即为阈值。
14.更进一步的，在本发明一个实施例中，训练集为19例dgf患者和22例非dgf患者，检测样本为尿液，根据risk score制作roc曲线，最后得到所述阈值为0.449722。
15.第三方面，本发明提供了所述的组合标志物在肾移植受者排斥风险评估中的应用。
16.第四方面，本发明提供了利用所述的组合标志物进行肾移植受者排斥风险评估的方法，包括以下流程：将受检尿液样本预处理，与核磁上机缓冲液混匀后上机完成核磁数据采集，并通过数据处理软件进行谱图解析及指标定量，最后将组合标志物的核磁检测数值通过公式转化为待测者的排斥风险预测分数值risk score，并用于判断待测者是否为肾移植排斥反应高风险受者。
17.进一步的，所述将组合标志物的核磁检测数值通过公式转化为待测肾移植受者的排斥风险预测分数值risk score：
18.risk score＝1/(1+e^(-(0.020403510*乙酸-0.000598003*柠檬酸-0.104102733*乙基丙二酸-0.007513717*戊二酸-0.001076258*l-色氨酸+0.004224403*乳酸+0.005415062*肌醇+0.106476174*异嘌呤醇-0.003641094*苯丙酮酸
19.+0.011974537*2-氧代异己酸-0.022673673*3-羟基戊二酸-0.104147022*3-羟基异戊酸-0.713367476)))；
20.阈值为0.449722，若risk score≥0.449722，则待测者为肾移植排斥反应高风险
受者，若risk score＜0.449722，则待测者为肾移植排斥反应低风险受者。
21.进一步的，所述核磁检测数值获取方法包括如下：
22.通过1h核磁共振波谱扫描完成尿液样本代谢数据采集，下机谱图通过bruker内置于topspin软件中的quantref管理系统进行归一化处理，使谱图的强度归一为mmol/l的质子浓度；基于bruker核磁自建库对核磁检测的谱图进行定性定量分析，得到待测尿液样本的定量报告；通过数据提取python程序对定量报告中的指标数据进行提取，即得所述核磁检测数值。
23.上述检测可为早期诊断dgf或评估肾移植术后排斥反应的风险等级。
24.本发明具有以下优点：尿液代谢物的改变在第一时间反应肾脏的状态，通过液体活检技术从尿液代谢中寻找组合生物标志物具有高度敏感性和特异性；利用本发明组合标志物进行样本检测，可达到无创、快速、准确的效果。可实时、动态进行肾移植术后早期诊断dgf并评估排斥反应的风险等级，不需要穿刺，仅需要取900μl左右的尿液进行核磁测样，核磁仪器稳定且重现性高，20min即可生成尿液代谢物报告。
25.实验证明，采用本发明提供的试剂盒可以判断待测尿液样本源于排斥反应高风险还是低风险的肾移植受者，模型准确率高达97.6％。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
26.图1为实施例1中的41例待测者risk score的分析结果。
27.图2为实施例1的roc曲线分析。
具体实施方式
28.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
29.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
30.下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
31.实施例1、肾移植受者排斥风险评估方法的建立
32.一、获得用于肾移植受者排斥风险检测的标志物
33.1.质控样本上机
34.质控标准品按照核磁仪器固定程序进行上机检测，根据谱图结果确保仪器状态良好、环境温度稳定、定量性能达标。自检合格后进行待测样本处理上机。
35.2.待测样本预处理及上机
36.从-80℃冰箱中取出尿液样本解冻，恢复室温后取900μl尿液和100μl核磁尿液缓冲液于ep管中，核磁尿液缓冲液中包括d2o、h2o、tsp、kh2po4。混合均匀后取600μl转至5mm核磁管。被检样本核磁管通过自动进样器逐一进入磁体进行检测，检测过程中使用标准温控流程，自动进样器设置为280k以保证待检样本质量，进样前通过气流对样本进行加热，确保样本达到检测温度(300k)。
37.3.数据采集与处理
38.通过1h核磁共振波谱扫描完成尿液样本代谢数据采集，下机谱图通过bruker内置于topspin软件中的quantref管理系统进行归一化处理，使谱图的强度归一为mmol/l的质
子浓度。基于bruker核磁自建库对核磁检测的谱图进行定性定量分析，得到待测尿液样本的定量报告。
39.二、利用标志物进行肾移植排斥风险检测
40.41例待测者包括22例非dgf患者(编号为c1-c22)，19例dgf患者(编号为d1-d19)。进行如下步骤：
41.1、通过数据提取python程序对每个待测者定量报告中的标志物数据进行提取，样本数据结果见表1。
42.表1
43.[0044][0045]
2、根据待测样本组合标志物的数值通过公式计算risk score，计算公式如下：risk score＝1/(1+e^(-(0.020403510*acetic acid-0.000598003*citric acid-0.104102733*ethylmalonicacid-0.007513717*glutaricacid-0.001076258*l-try ptophan+0.004224403*lacticacid+0.005415062*myo-inositol+0.106476174*oxypu rinol-0.003641094*phenylpyruvicacid+0.011974537*2-oxoisocaproicacid-0.022673673*3-hydroxyglutaric acid-0.104147022*3-hydroxyisovaleric acid-0.713367476)))。41例待测者的risk score结果见表2和图1，结果表明，与非dgf组相比，dgf组的risk score显著增加。
[0046]
表2
[0047]
[0048][0049]
3、阈值的获得：用r包glmnet 4.1-7对步骤2中的结果进行roc曲线分析(图2)。roc曲线下面积为0.983，根据灵敏度和特异性制作受试者工作特征曲线，当灵敏度与特异性之和最大时，此时risk score的值即为阈值，阈值为0.449722。这一节点上，显示出94.7％的敏感性和100％的特异性。
[0050]
4、将步骤2得到的risk score和阈值进行比较，区分排斥反应高风险或低风险的肾移植受者。区分标准如下：如果risk score≥0.449722，则待测者为肾移植排斥反应高风险或疑似为高风险受者，如果risk score＜0.449722，则待测者为肾移植排斥反应低风险或疑似为低风险受者。
[0051]
本实施例提供的方法通过对尿液的检测就可以鉴定待测者为肾移植排斥反应高风险还是低风险患者。
[0052]
实施例2、准确性验证实验
[0053]
选取8例非dgf患者(编号为a1-a8)和6例dgf患者(编号为b1-b6)尿液样本，对其risk score进行测定，每个待测样本进行如下实验：
[0054]
一、获得用于肾移植受者排斥风险检测的标志物
[0055]
同实施例1的步骤一。
[0056]
二、利用标志物进行肾移植排斥风险检测
[0057]
1、同实施例1的步骤二中1。对14个待测样本的标志物数据进行提取，样本数据结果见表3。
[0058]
表3
[0059]
[0060][0061]
2、同实施例1的步骤二中2。14个待测样本的risk score见表4中第2列。
[0062]
3、同实施例1的步骤二中4。区分待测样本来源于排斥反应高风险还是低风险的肾移植受者，14个待测样本判读结果见表4中第3列。
[0063]
结果表明(表4中第4列)，采用实施例1建立的方法可以判断待测样本来源于排斥反应高风险还是低风险的肾移植受者，判读结果一致，具有较高的准确性。
[0064]
表4
[0065]
待测者编号risk score判读结果一致性a10.282713099低风险一致a20.287354567低风险一致a30.446559749低风险一致a40.372266286低风险一致a50.202722405低风险一致a60.384592814低风险一致a70.401570931低风险一致a80.322747566低风险一致b10.723585677高风险一致b20.613461886高风险一致b30.764386081高风险一致b40.988883436高风险一致b50.517166480高风险一致b60.729669115高风险一致
[0066]
注：低风险为来源于非dgf患者，高风险为来源于dgf患者。

技术特征：
1.组合标志物在制备肾移植受者排斥风险评估试剂盒中的应用，所述组合标志物包括：乙酸、柠檬酸、乙基丙二酸、戊二酸、l-色氨酸、乳酸、肌醇、异嘌呤醇、苯丙酮酸、2-氧代异己酸、3-羟基戊二酸、3-羟基异戊酸。2.一种肾移植受者排斥风险评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述组合标志物的检测试剂。3.如权利要求2所述的肾移植受者排斥风险评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括数据处理系统；所述数据处理系统能够将组合标志物的核磁检测数值通过以下公式转化为待测肾移植受者的排斥风险分数值risk score，并用于判断待测肾移植受者为排斥反应高低风险患者；所述待测者的risk score计算方法为：risk score＝1/(1+e^(-(0.020403510*乙酸-0.000598003*柠檬酸-0.104102733*乙基丙二酸-0.007513717*戊二酸-0.001076258*l-色氨酸+0.004224403*乳酸+0.005415062*肌醇+0.106476174*异嘌呤醇-0.003641094*苯丙酮酸+0.011974537*2-氧代异己酸-0.022673673*3-羟基戊二酸-0.104147022*3-羟基异戊酸-0.713367476)))；判断方法为：如果risk score≥阈值，则待测者为肾移植排斥反应高风险受者，如果risk score＜阈值，则待测者为肾移植排斥反应低风险受者；所述阈值通过受试者工作特征曲线确定，具体方法为：构建训练集，训练集由n例dgf患者和m例非dgf患者组成，n和m均为自然数；获得训练集中所有患者的risk score，根据灵敏度和特异性制作受试者工作特征曲线，当受试者工作特征曲线上灵敏度与特异性之和最大时，此时risk score的值即为阈值。4.如权利要求3所述的肾移植受者排斥风险评估试剂盒，其特征在于，所述阈值为0.449722。5.权利要求1所述的组合标志物在肾移植受者排斥风险评估中的应用。6.利用权利要求1所述的组合标志物进行肾移植受者排斥风险评估的方法，其特征在于，包括以下流程：将受检尿液样本预处理，与核磁上机缓冲液混匀后上机完成核磁数据采集，并通过数据处理软件进行谱图解析及指标定量，最后将组合标志物的核磁检测数值通过公式转化为待测者的排斥风险预测分数值risk score，并用于判断待测者是否为肾移植排斥反应高风险受者。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述将组合标志物的核磁检测数值通过公式转化为待测肾移植受者的排斥风险预测分数值risk score：risk score＝1/(1+e^(-(0.020403510*乙酸-0.000598003*柠檬酸-0.104102733*乙基丙二酸-0.007513717*戊二酸-0.001076258*l-色氨酸+0.004224403*乳酸+0.005415062*肌醇+0.106476174*异嘌呤醇-0.003641094*苯丙酮酸+0.011974537*2-氧代异己酸-0.022673673*3-羟基戊二酸-0.104147022*3-羟基异戊酸-0.713367476)))；阈值为0.449722，若risk score≥0.449722，则待测者为肾移植排斥反应高风险受者，若risk score＜0.449722，则待测者为肾移植排斥反应低风险受者。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核磁检测数值获取方法包括如下：通过1h核磁共振波谱扫描完成尿液样本代谢数据采集，下机谱图通过bruker内置于
topspin软件中的quantref管理系统进行归一化处理，使谱图的强度归一为mmol/l的质子浓度；基于bruker核磁自建库对核磁检测的谱图进行定性定量分析，得到待测尿液样本的定量报告；通过数据提取python程序对定量报告中的指标数据进行提取，即得所述核磁检测数值。

技术总结
本发明公开了一种组合标志物及其在制备评估肾移植受者排斥反应风险试剂盒的应用。所述组合标志物包括：乙酸、柠檬酸、乙基丙二酸、戊二酸、L-色氨酸、乳酸、肌醇、异嘌呤醇、苯丙酮酸、2-氧代异己酸、3-羟基戊二酸、3-羟基异戊酸。通过检测本发明提供的组合标志物可以判断待测尿液样本来源于排斥反应高风险还是低风险的肾移植受者，验证结果与患者实际情况一致，具有较高的准确性。可见本发明通过早期诊断DGF，评估肾移植术后排斥反应的风险等级，是及时调整治疗方案、合理使用免疫抑制剂的关键，具有重要的应用价值。具有重要的应用价值。具有重要的应用价值。


技术研发人员：刘冰倩 李臻 姜浩 赵薇 李捷
受保护的技术使用者：谱天（天津）生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.06
技术公布日：2023/8/6