新型高效的先导编辑器及其应用

1.本发明属于生物医药领域，涉及新型高效的先导编辑器及其应用，开发的新型高效的先导编辑器(prime editors):spes and tpes技术属于基因治疗的平台技术，可以用于定点突变，插入，筛除基因组dna片段等疾病的基因治疗。


背景技术：

2.人类的疾病大多与基因密切相关，所以根据基因进行针对性的改变一直是生命科学的长期愿望。尽管基因编辑技术取得了快速进展，但与疾病相关的75000多个人类已知的遗传变异中，大多数疾病还是存在难以纠正的问题。
3.利用工程性核酸酶例如zfps,talens或者crispr-cas可以有效的利用dna 双链断裂(double strand breaks,dsbs)介导的dna编辑方式，在特定基因组位点进行插入与缺失。但是，dsb的产生会导致许多不良的结果，比如编辑不单一，基因序列易位和p53的激活。
4.在细胞体内，染色质经常发生dna双链断裂(dna double-strand breaks, dsbs)一方面是在减数分裂重组和脊椎动物免疫系统发育过程中所必需的，另一方面，dsb的错误修复会产生突变并促进基因组不稳定，无法修复dsbs会导致细胞死亡。通常来说，有两种主要的修复机制会被dsb所激活，一种是同源性介导修复(homology-directed repair，hdr),另一种是非同源末端连接(non
‑ꢀ
homologous end joining，nhej)。作为dna双链断裂最主要的修复通路，hdr 使用同源序列作为修复的模板以完成基因序列的校正，并且只能发生在细胞 g2/s期；相反，nhej在修复过程不需要同源序列就能在dsb附近的基因组位点引入插入和缺失。但是，由于同源重组机制本身的局限性，hdr介导的基因校正效率一直都很低(通常小于5％)。因此，极大的限制了crispr/cas基因编辑工具从科研向应用的转变。应运而生的碱基编辑器(base editor,be)，胞嘧啶和腺苷碱基编辑器可将c
·
g转化为t
·
a，将a
·
t转化为g
·
c，该方法虽然能极大的提高基因位点的编辑效率，但是该方法突变的方式单一并且需要 dna双链断裂，对于精准治疗方面的应用，这些方法都具有一定的局限性。
5.先导编辑(prime editing)是在2019年底由mit david liu实验室发明的。这项技术被认为是基于crispr的第三代基因编辑技术，可以对基因组中的任何位点进行精确地点突变、小片段dna的插入和缺失。目前先导编辑的主要问题是编辑效率在不同的细胞，不同的位点差异很大。所以优化先导编辑的效率迫在眉睫。


技术实现要素：

6.先导编辑(prime editing)可以在没有双链断裂的情况下定点突变，插入，筛除基因组dna片段。先导编辑器(prime editors)中pegrna的稳定性和错误折叠会影响先导编辑的效率。与受cas9蛋白保护的sgrna相比，pegrna 的3
‘
延伸部分可能暴露在细胞中，更容易受到外切核酸酶的降解，我们通过在pegrna的3'末端加入rna颈环结构开发了spes,通过让pegrna的3'末端结合到cas9，开发了tpes，以此来以此来提高cas9/pegrna复合物的稳定性，降低3’末端的降解能力。spes和tpes极大的提高了先导编辑的效率。
7.本发明的目的之一是提供一种基因先导编辑系统，包含载体，所述载体含有编码pegrna的基因以及编码融合蛋白的基因，所述pegrna包含sgrna、逆转录模板rtt、主要结合位点pbs和rna茎环结构；所述融合蛋白为cas9 切口酶或其变体与逆转录酶的融合蛋白。
8.其中，所述rna茎环结构选自以下至少一项：
9.1)序列分别如seq id no.1～4所示的ms2、pp7、combs或csy4bs；
10.2)在1)的5
′
端和/或3
′
端添加一个或几个核苷酸得到的rna序列；
11.3)与1)或2)的rna序列具有85％以上的同一性的rna序列。
12.所述rna茎环结构连接于所述主要结合位点pbs的3’端；
13.所述pegrna为rna分子，从5’端至3’端依次为sgrna、逆转录模板 rtt、主要结合位点pbs和rna茎环结构；
14.所述融合蛋白还含有rna结合蛋白rbp；所述rbp为特异性结合rna 茎环结构的蛋白；所述rbp为一个或多个；
15.所述融合蛋白还含有rna结合蛋白rbp；所述融合蛋白由n端至c端依次包括rbp、cas9或其变体、逆转录酶；
16.所述载体为一个或多个；
17.所述编码pegrna的基因或编码融合蛋白的基因为一个或多个；
18.所述编码pegrna的基因或编码融合蛋白的基因位于同一载体或不同载体上。
19.所述rbp选自tdmcp、tdpcp、com、csy4h29a中的任一种；
20.所述cas9切口酶为h840a；
21.所述逆转录酶为mmlv；
22.所述系统还含有筛选标记蛋白。
23.本发明另一目的是提供一种pegrna，所述pegrna为如上任一项所述的系统中所述的pegrna。
24.本发明另一目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为如上任一项所述的系统中所述的融合蛋白。
25.本发明另一目的是提供一种核酸，所述核酸编码如上所述的pegrna和/或融合蛋白。
26.本发明另一目的是提供一种构建体，所述构建体含有如上所述的核酸。
27.本发明另一目的是一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的构建体或基因组中整合有外源的如上所述的核酸。
28.如上所述的系统、pegrna、融合蛋白、核酸、构建体或宿主细胞在以下至少一项中的应用：
29.1)用于生物体或生物细胞基因组序列的编辑；优选地，用于碱基替换；
30.2)用于制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；
31.3)用于提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；
32.4)用于制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
33.其中，用于dna编辑或rna编辑；优选地，用于dna编辑；进一步优选地，用于srd5a3，dyrk1a，hdac1，bcl11a，gfap，runx1，jak2， srd5a1，dmd和eed位点的编辑；更进一步优选地，用于srd5a3_+2c
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g 到a
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t，dyrk1a_+1c
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a，srd5a1_+1c
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t，dmd_+1t
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g和eed_+1a
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t到t
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a 的编辑。
34.本发明的另一目的是提供一种基因编辑的方法，包括将如上所述的系统、 pegrna、融合蛋白、核酸、构建体或、宿主细胞导入待编辑体中实现基因的编辑。
附图说明
35.图1.spe-ms2和tpe-ms2提高了不同位点的pe效率在u2os细胞中。
36.图2.spe-ms2和tpe-ms2提高了不同位点的pe效率在293ft细胞中
37.图3.spe-ms2和tpe-ms2提高了不同位点的pe效率在hela细胞中
38.图4.spes和tpes不同适配体的编辑效率
39.图5.(a)引导编辑(prime editing,pe)系统。引导编辑(pe)复合物由化脓性链球菌cas9-h840a(天蓝色)和逆转录酶mmlv(黄色)的c端融合形成cas9
‑ꢀ
h840a-mmlv融合蛋白和pegrna包含主要结合位点(prime binding site,pbs) (蓝绿色)和sgrna 3'-末端的逆转录模板(rtt，红紫色)组合。(b)spe系统。在pe系统的基础上，将rna茎环配体(橙色)加到pegrna的3'-末端(c) tpe系统。在pe系统的基础上，将rna结合蛋白(rbp，蓝色)融合到cas9 的n端，可以与3
‘
末端的rna茎环结构结合。
40.图6.构建用于pe的ppb-pe-all-rna、用于spe和tpe的ppb-spe-all-rna 质粒。
具体实施方式
41.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。
42.本发明采用通过在pegrna的3'末端加入rna颈环结构开发了spes,通过让pegrna的3'末端结合到cas9,开发了tpes，以此来降低3’末端的降解能力，进一步的提高在不同细胞中不同基因组位点的编辑效率。
43.本发明以srd5a3,dyrk1a,hdac1,bcl11a,gfap,runx1,jak2,srd5a1,dmd 和eed这些不同基因位点在u2os细胞(实施案例1),293ft细胞(实施案例2), hela细胞(实施案例3)中的spe,tpe的编辑效率为例说明spe和tpe在不同细胞中相比于pe均提高了编辑效率，为证明该方法不限制与ms2一个适配子，本发明尝试了com,boxb,pp7,csy4不同适配子中spe和tpe的编辑效率(实施案例4)。
44.实施例1：
45.在u2os细胞中本发明测试了10个基因位点包括srd5a3_+2c
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t，dyrk1a_+1c
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c，hdac1_+1c
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c，bcl11a_+1c
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a，srd5a1_+1c
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t，dmd_+1t
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a到c
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g和eed_+1a
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t到 t
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a，使用spe-ms2或tpe-ms2系统的编辑效率相比于pe系统的编辑效率平均提高2.5或3.1倍。spe-ms2或tpe-ms2能将pe编辑很低的位点srd5a3_+2 c
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t，dyrk1a_+1c
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c，jak2_+1c
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a，srd5a1 _+1c
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g到a
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t和dmd_+1t
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a到c
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g，平均提高3.4或3.9倍。
46.图1.spe-ms2和tpe-ms2提高了不同位点的pe效率在u2os细胞中(左)pe、spe-ms2
和tpeb-ms2介导的点突变srd5a3_+2c
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t， dyrk1a_+1c
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c，hdac1_+1c
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t， gfap_+1a
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a和runx1_+5g
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a在u2os细胞中的编辑效率。(右)pe、spe-ms2和tpe-ms2介导的点突变jak2_+1c
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a， srd5a1_+1c
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t，dmd_+1t
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a到c
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g和eed_+1a
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a 在u2os细胞中的编辑效率。
47.实施例2：
48.在293ft细胞中本发明测试了10个基因位点包括srd5a3_+2c
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t，dyrk1a_+1c
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a，srd5a1_+1c
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t，dmd_+1t
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a，使用spe-ms2或tpe-ms2系统的编辑效率相比于pe系统的编辑效率平均提高1.8或1.9倍。spe-ms2或tpe-ms2能将pe编辑很低的位点srd5a3_+2 c
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a，srd5a1 _+1c
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g，平均提高2.5或2.6倍。
49.图2.spe-ms2和tpe-ms2提高了不同位点的pe效率在293ft细胞中 (左)pe、spe-ms2和tpeb-ms2介导的点突变srd5a3_+2c
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t， dyrk1a_+1c
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a在293ft细胞中的编辑效率。(右)pe、spe-ms2和tpe-ms2介导的点突变jak2_+1c
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a， srd5a1_+1c
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t，dmd_+1t
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a到c
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g和eed_+1a
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a 在293ft细胞中的编辑效率。
50.实施例3：
51.在hela细胞中本发明测试了10个基因位点包括srd5a3_+2c
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t，dyrk1a_+1c
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a，runx1_+5g
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a，jak2_+1c
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a，srd5a1_+1c
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t，dmd_+1t
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g和eed_+1a
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t到 t
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a，使用spe-ms2或tpe-ms2系统的编辑效率相比于pe系统的编辑效率平均提高3.7或2.7倍。spe-ms2或tpe-ms2能将pe编辑很低的位点srd5a3_+2 c
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t，dyrk1a_+1c
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c，jak2_+1c
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a，srd5a1 _+1c
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t和dmd_+1t
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a到c
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g，平均提高6.2或4.9倍
52.图3.spe-ms2和tpe-ms2提高了不同位点的pe效率在hela细胞中
53.(左)pe、spe-ms2和tpeb-ms2介导的点突变srd5a3_+2c
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g到a
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t， dyrk1a_+1c
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c，hdac1_+1c
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c，bcl11a_+1c
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a和runx1_+5g
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a在hela细胞中的编辑效率。(右)pe、spe-ms2和tpe-ms2介导的点突变jak2_+1c
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a， srd5a1_+1c
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t，dmd_+1t
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g和eed_+1a
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t到t
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a 在hela细胞中的编辑效率。
54.实施例4：
55.为确保spe或tpe对pe效率的提高不限于ms2茎环，我们测试了另外三种rna茎环适体，包括com结合位点(combs)、csy4结合位点 (csy4bs)和pp7。rna适配体combs、csy4bs或pp7标记到pegrna的3'
‑ꢀ
末端分别生成spe-com、spe-cys4或spe-pp7。在293ft细胞中，所有spe-com、 spe-cys4、spe-pp7系统均提高了runx1位点的g到t颠换突变的效率。 tpe-com、tpe-cys4系统也提高了runx1位点点突变的效率。
56.图4.spes和tpes不同适配体的编辑效率
57.spes和tpes在hek293ft细胞中使用pe3介导runx1_+5g
·
c到t
·
a颠换的点突变编
辑效率。combs、csy4bs、pp7或ms2 rna适配体分别附加到 spe-com的com、spe-csy4的csy4、spe-pp7的tdpcp和spe-ms2的tdmcp 的pegrna的3'-末端。cas9h840a-mmlv的n端与tpe-com的同源rna 结合蛋白com、tpe-csy4的csy4、tpe-pp7的tdpcp和tpe-ms2的tdmcp 融合。
58.具体的，实验方法包括下列步骤：
59.1.1实验材料
60.1.1.1试剂及质粒
61.引物合成自苏州金唯智生物有限公司；限制性内切酶、dna连接酶、高保真dna聚合酶购自neb公司；质粒重组试剂盒clone和胶回收试剂盒购自vazyme公司；pcmv-be3来自addgene网站；转染试剂2000，购自thermo fisher公司；quickextract
tm
基因组dna抽提试剂购自illumina公司。
62.1.1.2细胞株
63.人胎肾细胞hek293ft(thermo fisher scientific)，人骨肉瘤细胞u2os和人宫颈癌细胞hela细胞培养在加入了10％胎牛血清(gbico)，1％双抗的dmem 培养基(gibco)中贴壁培养。
64.1.2实验方法
65.1.2.1构建表达质粒
66.用于spe和tpe的修饰的pegrna表达质粒ppb-pe-all-rna、ppb-spe
‑ꢀ
all-rna是通过两个步骤产生的(图6)。首先，分别构建了ppe-pegrna、pspe
‑ꢀ
pegrna和ppe3-sgrna。对于ppe-pegrna、pspe-pegrna，合成寡核苷酸(补充表格1)并在上游引物和下游引物接上5'accg和3'aaaa然后退火(表 1.2.1.3)，并克隆到plh-aaaa骨架质粒(补充序列s1)中。对于ppe3-sgrna，合成寡核苷酸并在上游引物和下游引物接上5'accg和3'aaac然后退火，然后克隆到plh-sgrna3骨架载体中(补充序列s1)。最后，使用golden gate克隆方法(表1.2.1.5)将相关的表达组分克隆到一个载体pdonor5.1(补充序列 s1)中，并生成ppb-pe-all-rna和ppb-spe-all-rna质粒。
67.rbp-spcas9-mmlv表达质粒是在pcmv-pe2(#addgene 132775)之上产生的，其中pe2是指spcas9h840a-mmlv(图6b)。首先，t2a-gfp被插入到 pcmv-pe2的c端，构成pcmv-pe2-t2a-gfp质粒。其次，合成包括tdmcp、 com、csy4h29a和tdpcp(补充序列s2)在内的茎环适配体的rna结合蛋白，并使用clonexpress ii一步克隆试剂盒(vazyme，c112-01)(表1.2.1.4)将其克隆到pcmv-pe2-t2a-gfp中，分别得到pcmv-tdmcp-pe2-t2a-gfp、pcmv-com
‑ꢀ
pe2-t2a-gfp、pcmv-csy4h29a-pe2-t2a-gfp和pcmv-tdpcp-pe2-t2a-gfp质粒。其中所有涉及到的pcr扩增(表1.2.1.1)和pcr程序(表1.2.1.2)。
68.步骤1.2.1中质粒构建实验中扩增各种片段使用pcr体系如下：
69.表1.2.1.1 pcr扩增体系
[0070][0071]
表1.2.1.2 pcr程序
[0072][0073][0074]
表1.2.1.3退火程序
[0075][0076]
表1.2.1.4同源重组反应
[0077][0078]
表1.2.1.5 sgrna golden gate组装反应
[0079][0080]
1.2.2细胞培养与转染和基因组抽提
[0081]
hek293ft(thermo fisher scientific)、hela(atcc,ccl-2)和u2os(atcc,htb
‑ꢀ
96)细胞在含有高葡萄糖的10％fbs(胎牛血清，thermo fisher scientific)的 dmem培养基中培养。所有细胞均在37℃、5％co2的加湿培养箱中培养。转染前，将细胞接种在12孔板中，细胞密度大约在60％左右，并使用 lipofectamine 2000(thermo fisher scientific)进行转染。为了测量基因编辑效率，在1.5ml离心管中，加入50μl opti-dmem，1.5μg prime editor 2(pe2,dcas9
‑ꢀ
mmlv)或rbp-pe2，以及500ng pe-all-rna、spe-all-rna或tpe-all-rna表达质粒。涡旋使其充分混匀，另取一个1.5ml离心管，加入50μl opti-dmem和 4μl lipofectamine 2000转染试剂，静置5min。将2管溶液合并，混匀后静置 15min共转染到hek293ft、u2os或hela细胞。转染后72小时，利用流式细胞术(bd facs aria)收集prime编辑器(gfp+)和pe-all-rna、spe-all-rna、 tpe-all-rna双阳性细胞。
[0082]
1.2.3基因组dna抽提和pcr扩增
[0083]
使用quickextract dna extraction solution(lucigen)按照试剂操作说明提取细胞的基因组，将抽提得到的基因组dna利用以下引物(补充表2)进行pcr 扩增。
[0084]
1.2.4深度测序
[0085]
使用包含truseq接头的基因座特异性引物从基因组dna中扩增感兴趣的基因组位点。合并等量的pcr产物并利用胶回收试剂盒凝胶进行纯化。使用双端150bp illumina miniseq运行对纯化的文库进行深度测序。
[0086]
图6.构建用于pe的ppb-pe-all-rna、用于spe和tpe的ppb-spe-all-rna 质粒。
[0087]
(a)ppb-pe-all-rna由ppe-pegrna、ppe3-sgrna和pdonor5.1通过goldengate组装而成，ppe-pegrna由sgrna(蓝色)、rtt(金色)和pbs(洋红色)、 ppe3-sgrna包含sgrnanick(橙色)，pdonor5.1由ccdb基因(绿色)、嘌呤霉素(黄色)、p2a(紫色)和tagbfp2(青色)组成。ppb-spe-all-rna由pspe
‑ꢀ
pegrna，ppe3-sgrna和pdonor5.1重组而成，pspe-pegrna包含sgrna(蓝色)、rtt(金色)、pbs(洋红色)和茎环rna适配体(深绿色)。(b)pcmv
‑ꢀ
rbp-pe2-t2a-sfgfp的构建。t2a-sfgfp插入到pcmv-pe2的c端，产生 pcmv-pe2-t2a-sfgfp，然后将包括茎环适配体的rna结合蛋白克隆到pcmv
‑ꢀ
pe2-t2a-sfgfp。
[0088]
ms2(seq id no.1)
[0089]
acatgaggatcacccatgt
[0090]
pp7(seqidno.2)
[0091]
ggagcagacgatatggcgtcgctcc
[0092]
combs(com蛋白结合位点)(seqidno.3)
[0093]
ctgaatgcctgcgagcatc
[0094]
csy4bs(csy4蛋白结合位点)(seqidno.4)
[0095]
actgccgtataggcagctaagaaa
[0096]
tdmcp(串联ms2外壳蛋白，结合ms2rna颈环结构的rna结合蛋白)(seqidno.5)
[0097]
asnftqfvlvdnggtgdvtvapsnfangiaewissnsrsqaykvtcsvrqssaqnrkytikvevpkgawrsylnmeltipifatnsdcelivkamqgllkdgnpipsaiaansgiyamasnftqfvlvdnggtgdvtvapsnfangiaewissnsrsqaykvtcsvrqssaqnrkytikvevpkgawrsylnmeltipifatnsdcelivkamqgllkdgnpipsaiaansgiya
[0098]
tdpcp(串联pp7外壳蛋白，结合pp7rna颈环结构的rna结合蛋白)(seqidno.6)
[0099]
sktivlsvgeatrtlteiqstadrqifeekvgplvgrlrltaslrqngaktayrvnlkldqadvvdsglpkvrytqvwshdvtivansteasrkslydltkslvatsqvedlvvnlvplgradplasktivlsvgeatrtlteiqstadrqifeekvgplvgrlrltaslrqngaktayrvnlkldqadvvdsglpkvrytqvwshdvtivansteasrkslydltkslvatsqvedlvvnlvplgr
[0100]
com(comrna结合蛋白，结合combsrna颈环结构的rna结合蛋白)(seqidno.7)
[0101]
gsmksirckncnkllfkadsfdhieircprckrhiimlnacehptekhcgkrekithsdetvrygstsghklngggggmdaksltaws
[0102]
csy4h29a(csy4结合蛋白h29a突变体，结合csy4bsrna颈环结构的rna结合蛋白)(seqidno.8)
[0103]
mdhyldirlrpdpefppaqlmsvlfgklaqalvaqggdrigvsfpdldesrsrlgerlrihasaddlrallarpwleglrdhlqfgepavvphptpyrqvsrvqaksnperlrrrlmrrhdlseeearkripdtvaraldlpfvtlrsqstgqhfrlfirhgplqvtaeeggftcyglskggfvpwf
[0104]
补充表格1
[0105]
ppe-pegrna
[0106]
jak2-f:
[0107]
ataattgaagacataccgacctgtgactcatgaaacacgtttgagagctagaaatagcaagttcaaataaggc(seqidno.9)
[0108]
jak2-r:
[0109]
ataattgaagacgcaaaactgtgactcatgaaatacaggaagaatgtgcaccgactcggtgcc(seqidno.10)
[0110]
hdac1-f:
[0111]
ataattgaagacataccggcaccatgcaaagaagtccggtttgagagctagaaatagcaagttcaaataaggc(seqidno.11)
[0112]
hdac1-r:
[0113]
ataattgaagacgcaaaatgcaaagaagtgcgaggcatctggctgcaccgactcggtgcc(seqidno.12)
[0114]
eed-f:
[0115]
ataattgaagacataccgccggttgttgcaatcttacggtttgagagctagaaatagcaag ttcaaataaggc(seq id no.13)
[0116]
eed-r:
[0117]
ataattgaagacgcaaaagttgttgcaatctttcgtggatgctgatgcaccgactc ggtgcc(seq id no.14)
[0118]
bcl11a-f:
[0119]
ataattgaagacataccgtcacagataaacttctgcacgtttgagagctagaaatagcaagttc aaataaggc(seq id no.15)
[0120]
bcl11a-r:
[0121]
ataattgaagacgcaaaacacagataaacttctgaactggaggggccgcaccgac tcggtgcc(seq id no.16)
[0122]
srd5a3-f:
[0123]
ataattgaagacataccgccttactcaatctctgttccgtttgagagctagaaatagcaagt tcaaataaggc(seq id no.17)
[0124]
srd5a3-r:
[0125]
ataattgaagacgcaaaattactcaatctctgttactgggagcaccttttcgcac cgactcggtgcc(seq id no.18)
[0126]
srd5a1-f:
[0127]
ataattgaagacataccgtccattcagatcatatcctagtttgagagctagaaatagcaagtt caaataaggc(seq id no.19)
[0128]
srd5a1-r:
[0129]
ataattgaagacgcaaaacattcagatcatatcataaggaatctcagaaagcaccg actcggtgcc(seq id no.20)
[0130]
dyrk1a-f:
[0131]
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[0132]
dyrk1a-r:ataattgaagacgcaaaacaaggacattgtaaggatgatgcaccgactcggtgcc (seq id no.22)
[0133]
dmd-f:
[0134]
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[0135]
dmd-r:
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[0137]
runx1-f:
[0138]
ataattgaagacataccggcattttcaggaggaagcgagtttgagagctagaaatagcaagttcaaata aggc(seq id no.25)
[0139]
runx1-r:
[0140]
ataattgaagacgcaaaaattttcaggaggaagcgattgcttcagacagcaccgactcggtgcc (seq id no.26)
[0141]
gfap-f:
[0142]
ataattgaagacataccgagcctgtgtccatataaagggttttagagctagaaatagcaagttaaaataa ggctagtc(seq id no.27)
[0143]
gfap-r:
[0144]
ataattgaagacgcaaaatgtgtccatataatggaggagttggaagcaccgactcgg tgcc(seq id no.28)
[0145]
pspe-pegrna
[0146]
jak2-ms2-f:
[0147]
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[0148]
jak2-ms2-r:
[0149]
ataattgaagacgcaaaaacatgggtgatcctcatgtctgtgactcatgaaatacaggaa gaatgtgcaccgactcggtgcc(seq id no.30)
[0150]
hdac1-ms2-f:
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[0152]
hdac1-ms2-r:
[0153]
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[0154]
eed-ms2-f:
[0155]
ataattgaagacataccgccggttgttgcaatcttacggtttgagagctagaaatagcaag ttcaaataaggc(seq id no.33)
[0156]
eed-ms2-r:
[0157]
ataattgaagacgcaaaaacatgggtgatcctcatgtgttgttgcaatctttcgtggatg ctgatgcaccgactcggtgcc(seq id no.34)
[0158]
bcl11a-ms2-f:
[0159]
ataattgaagacataccgtcacagataaacttctgcacgtttgagagctagaaatagcaagttc aaataaggc(seq id no.35)
[0160]
bcl11a-ms2-r:
[0161]
ataattgaagacgcaaaaacatgggtgatcctcatgtcacagataaacttctgaactgga ggggccgcaccgactcggtgcc(seq id no.36)
[0162]
srd5a3-ms2-f:
[0163]
ataattgaagacataccgccttactcaatctctgttccgtttgagagctagaaatagcaagt tcaaataaggc(seq id no.37)
[0164]
srd5a3-ms2-r:
[0165]
ataattgaagacgcaaaaacatgggtgatcctcatgtttactcaatctctgttactggga gcaccttttcgcaccgactcggtgcc(seq id no.38)
[0166]
srd5a1-ms2-f:
[0167]
ataattgaagacataccgtccattcagatcatatcctagtttgagagctagaaatagcaagtt caaataaggc(seq id no.39)
[0168]
srd5a1-ms2-r:
[0169]
ataattgaagacgcaaaaacatgggtgatcctcatgtcattcagatcatatcataaggaat ctcagaaagcaccgactcggtgcc(seq id no.40)
[0170]
dyrk1a-ms2-f:
[0171]
ataattgaagacataccgagcacatcaaggacattctagtttgagagctagaaatagcaagttcaaata aggc(seq id no.41)
[0172]
dyrk1a-ms2-r:
[0173]
ataattgaagacgcaaaaacatgggtgatcctcatgtcaaggacattgtaaggatgatgcaccgactcg gtgcc(seq id no.42)
[0174]
dmd-ms2-f:
[0175]
ataattgaagacataccgctacctctgtgatactcttcgtttgagagctagaaatagcaagt tcaaataaggc(seq id no.43)
[0176]
dmd-ms2-r:
[0177]
ataattgaagacgcaaaaacatgggtgatcctcatgtacctctgtgatactcctcaggtg cacctgcaccgactcggtgcc(seq id no.44)
[0178]
runx1-ms2-f：
[0179]
ataattgaagacataccggcattttcaggaggaagcgagtttgagagctagaaatagcaagttcaaata aggc(seq id no.45)
[0180]
runx1-ms2-r:ataattgaagacgcaaaaacatgggtgatcctcatgtattttcaggaggaagcgattgcttcagacag caccgactcggtgcc(seq id no.46)
[0181]
gfap-ms2-f:
[0182]
ataattgaagacataccgagcctgtgtccatataaagggttttagagctagaaatagcaagttaaaataa ggctagtc(seq id no.47)
[0183]
gfap-ms2-r:
[0184]
ataattgaagacgcaaaaacatgggtgatcctcatgttgtgtccatataatggaggagtt ggaagcaccgactcggtgcc(seq id no.48)
[0185]
runx1-com-f:
[0186]
ataattgaagacataccggcattttcaggaggaagcgagtttgagagctagaaatagcaagttcaaata aggc(seq id no.49)
[0187]
runx1-com-r:
[0188]
ataattgaagacgcaaaagatgctcgcaggcattcagattttcaggaggaagcgattgctt cagacagcaccgactcggtgcc(seq id no.50)
[0189]
runx1-pp7-f:
[0190]
ataattgaagacataccggcattttcaggaggaagcgagtttgagagctagaaatagcaagttcaaata aggc(seq id no.51)
[0191]
runx1-pp7-r:
[0192]
ataattgaagacgcaaaaggagcgacgccatatcgtctgctccattttcaggaggaagcgattgcttcagacagcaccgactcggtgcc(seqidno.52)
[0193]
runx1-csy4-f:
[0194]
ataattgaagacataccggcattttcaggaggaagcgagtttgagagctagaaatagcaagttcaaataaggc(seqidno.53)
[0195]
runx1-csy4-r：
[0196]
ataattgaagacgcaaaactgcctatacggcagtgaacattttcaggaggaagcgattgcttcagacagcaccgactcggtgcc(seqidno.54)
[0197]
ppe3-sgrna
[0198]
jak2-f:accgtggggtttgatcgttttctt(seqidno.55)jak2-r:aaacaagaaaacgatcaaacccca(seqidno.56)
[0199]
hdac1-f:accgatactttagcagttccagg(seqidno.57)hdac1-r:aaactcctggaactgctaaagtat(seqidno.58)
[0200]
eed-f:accgtgattaatttataaaagttt(seqidno.59)eed-r:aaacaaacttttataaattaatca(seqidno.60)
[0201]
bcl11a-f:accgctgcactcatcccaggcgtg(seqidno.61)bcl11a-r:aaaccacgcctgggatgagtgcag(seqidno.62)
[0202]
srd5a3-f:accgccagtaacagagattgagta(seqidno.63)srd5a3-r:aaactactcaatctctgttactgg(seqidno.64)
[0203]
srd5a1-f:accgtccttatgatatgatctgaa(seqidno.65)srd5a1-r:aaacttcagatcatatcataagga(seqidno.66)
[0204]
dyrk1a-f:accgaagagtgaggagaaggcagg(seqidno.67)dyrk1a-r:aaaccctgccttctcctcactctt(seqidno.68)
[0205]
dmd-f:accggtcaatgctctccttttcac(seqidno.69)dmd-r:aaacgtgaaaaggagagcattgac(seqidno.70)
[0206]
runx1-f:accgcatgtactcacctctcatga(seqidno.71)runx1-r:aaactcatgagaggtgagtacatg(seqidno.72)
[0207]
补充表格2
[0208]
gene
[0209]
jak2-f:ctacacgacgctcttccgatctgtggcggcatgattttgt(seqidno.73)
[0210]
jak2-r:agacgtgtgctcttccgatctccaagcattttagataag(seqidno.74)
[0211]
hdac1-f:ctacacgacgctcttccgatcttcatgcccagcaagtgctgtgaaac(seqidno.75)hdac1-r:agacgtgtgctcttccgatctgacactcaccgagcacatcctagcc(seqidno.76)
[0212]
eed-f:ctacacgacgctcttccgatctagttggagagagtatgttttctatacttgagatga(seqidno.77)eed-r:agacgtgtgctcttccgatctaactagatacaggattctcttgggtgatagtg(seqidno.78)
[0213]
bcl11a-f:ctacacgacgctcttccgatcttattttaatggaattgaaatgtgatatcctgtggtttatgatg(seqidno.79)bcl11a-r:agacgtgtgctcttccgatctccttcagtacttaaaaagtaagggcaatttccagaaa(seqidno.80)
[0214]
srd5a3-f:ctacacgacgctcttccgatcttgcctcgcttgttttccttttgcagat(seqidno.81)
[0215]
srd5a3-r:agacgtgtgctcttccgatctgcccttctgaggaggtgccg(seqidno.82)
[0216]
srd5a1-f:ctacacgacgctcttccgatctgaaattttacggtttattagccataatcatcttgcaa(seqidno.83)srd5a1-r:agacgtgtgctcttccgatctgatgacttacactgaaaacttgtagctaataactactacg(seqidno.84)
[0217]
dyrk1a-f:ctacacgacgctcttccgatctcttgtcacacacaatgaaactttgctgttcact(seqidno.85)dyrk1a-r:agacgtgtgctcttccgatctagtagctaacatttttcagtacttaactatatgccagctat(seqidno.86)
[0218]
dmd-f:
[0219]
ctacacgacgctcttccgatctaagcattaaatcttaagactacaagacattacttgaagg(seqidno.87)dmd-r:agacgtgtgctcttccgatctgacagagaagggtgtaaaagcttctagc(seqidno.88)
[0220]
runx1-f:ctacacgacgctcttccgatcttggttttcgctccgaaggtaaaagaa(seqidno.89)runx1-r:agacgtgtgctcttccgatctatatgcctcagtttgaattcctctcacaaacaag(seqidno.90)
[0221]
gfap-f：ctacacgacgctcttccgatcttactggggaaagcagtgcaggagca(seqidno.91)gfap-r:agacgtgtgctcttccgatctaccaccgcttcacagctgtgc(seqidno.92)
[0222]
补充表格3
[0223]
gene
[0224]
jak2:gtggcggcatgattttgtgcacggatggataaaagtacctgtgactcatgaaacacaggaagaatgtcttgggatggcagtgttagatatgatgagaatagccaaagaaaacgatcaaaccccactggccatctataactctatcaggtaattttcttttgcaaatccttacacataagtgtgagtagagattttatataattcgtatatattttctgtgtttacccatgccttttgattttgtaatactagttaagtactccttatctaaaatgcttgg(seqidno.93)
[0225]
hdac1:tcatgcccagcaagtgctgtgaaacttaataagcagcagacggacatcgctgtgaattgggctgggggcctgcaccatgcaaagaagtccgaggcatctggcttctgttacgtcaatgatatcgtcttggccatcctggaactgctaaagtatgcctgcctggccttgtctcttggaagagcaccttaggccaggttcccatttccctcttcccctgggcttgcctccctagtttgcttttcctaccgatgtgctggctaggatgtgctcggtgagtgtc(seqidno.94)
[0226]
eed:agttggagagagtatgttttctatacttgagatgaaatttactgtatttttattttcattaggttaccttgtatgaatgtcattcacaaggagaaatccggttgttgcaatcttacgtggatgctgatgtatcctttcctgggtttttaatatctttagtcaaaggaatttattttcaataagtgcaccaaaacttttataaattaatcatttccctaaagttattgttctttcttaaccgatttcttcactatcacccaagagaatcctgtatctagtt(seqidno.95)
[0227]
bcl11a:tattttaatggaattgaaatgtgatatcctgtggtttatgatgcacgttgtttgtagctgtagtgcttgattttgggtttctttcacagataaacttctgcactggaggggcctctcctcccctcgttctgcacatggagctctaatccccacgcctgggatgagtgcagaatatgccccgcagggtatttgtaagttgagccttatttcttctacaaatgtccatgtgtatagagatgagaatttctggaaattgcccttactttttaagtactgaagg(seqidno.96)
[0228]
srd5a3:tgcctcgcttgttttccttttgcagatatttttcccacttttatatcatctcagtgctgtggaatggcttcctgctttggtgccttactcaatctctgttcctgggagcaccttttccaagctggcttcatggtttgctcagaattctcggggcggcacagttccagggtaaggactccctgggcttatgacaacgctgcatcccgtttctgttgttcctgtctgcaagggagcagtttttggcattttgtctcctctctcggcacctcctcagaagggc(seqidno.97)
[0229]
srd5a1:
[0230]
gaaattttacggtttattagccataatcatcttgcaatttttttcctttaggttttggcttgtggttaacgggcatgttgataaacatccattcagatcatatcctaaggaatctcagaaaaccaggagatactggatacaaaataccaaggggtacgtacagaaagtgaagaatttctgtgaaagttgcttgccatggttcctggctattttagtgttgccagctctaagaagtagtagcgtagtagttattagctacaagttttcagtgtaagtcatc(seqidno.98)
[0231]
dyrk1a:
[0232]
cttgtcacacacaatgaaactttgctgttcactgtcagttataacttacatgaggtgacccatttccattcaagggttttagaagcacatcaaggacattctaaggatgattgacttacacaatgatctctgaacatgcctcctgccttctcctcactcttgagtatttgcttaggggagcagaaaaaatactggtagcattactgtaacattttaattctgctttatttaaaaaagacatagctggcatatagttaagtactgaaaaatgttagctact(seqidno.99)
[0233]
dmd:
[0234]
aagcattaaatcttaagactacaagacattacttgaaggtcaatgctctccttttcacaggctactcaaaaagagattgagaaacagaaggtgcacctgaagagtatcacagaggtaggagaggccttgaaaacagttttgggcaagaaggagacgttggtggaagataaactcagtcttctgaatagtaactggatagctgtcacctcccgagcagaagagtggttaaatcttttgttggtaagagaaaaggctagaagcttttacacccttctctgtc(seqidno.100)
[0235]
runx1:
[0236]
tggttttcgctccgaaggtaaaagaaatcattgagtcccccgccttcagaagagggtgcattttcaggaggaagcgatggcttcagacagcatatttgagtcatttccttcgtacccacagtgcttcatgagaggtgagtacatgctggtcttgtaatatctacttttgctcagctttgcctgtaatgaaatggcagcttgtttcacctcggtgcagagatgcctcggtgcctgccagttccctgtcttgtttgtgagaggaattcaaactgaggcatat(seqidno.101)
[0237]
gfap:
[0238]
tactggggaaagcagtgcaggagcagcggggcccctgtgtttcattcatggctgggctttgtgactgtgggcagcgagctcacctattctgagcctgtgtccatataaaggaggagttggaagcggagaaggttgatgtccatgagggagattggattctggggtgaagaaagtgagggaaagagcaggcaggtctgggcgcaaagcacaggtgactgcctgccaccagcttgtgacccccatcaagttactttgacttgcacagctgtgaagcggtggt(seqidno.102)
[0239]
补充序列1
[0240]
pdonor5.1
[0241]
acggatcgggagatctaccggtacgcgttgacgtgtcttcggatccggcttactaaaagccagataacagtatgcgtatttgcgcgctgatttttgcggtataagaatatatactgatatgtatacccgaagtatgtcaaaaagaggtatgctatgaagcagcgtattacagtgacagttgacagcgacagctatcagttgctcaaggcatatatgatgtcaatatctccggtctggtaagcacaaccatgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacgct ggaaagcgg
aaaatcaggaagggatggctgaggtcgcccggtttattgaaatgaacggctcttttgctga cgagaacaggggctggtgaaatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgttt gtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtc tgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatg accaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaa aatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctcccttatacacagcca gtctgcaggtcgacgaagacccactcgcggccgcttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttg cgcagggacgcggctgctctgggcgtggttccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcac attcttcacgtccgttcgcagcgtcacccggatcttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcct gctccgcccctaagtcgggaaggttccttgcggttcgcggcgtgccggacgtgacaaacggaagccgc acgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgccagggagcaatggcagcgcgccgaccgcgatg ggctgtggccaatagcggctgctcagcagggcgcgccgagagcagcggccgggaaggggcggtgc gggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcctgcccgcgcggtgttccgcattctgcaagcc tccggagcgcacgtcggcagtcggctccctcgttgaccgaatcaccgacctctctccccagggggatcc gccaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtac gcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatc gagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtc gcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttc gccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaag gcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgac caccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggg gtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtca ccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgccgctag cggtgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggtagtgg aacgcgtatggtgtctaagggcgaagagctgattaaggagaacatgcacatgaagctgtacatggagg gcaccgtggacaaccatcacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggcaccc agaccatgagaatcaaggtggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatcctggctactagcttc ctctacggcagcaagaccttcatcaaccacacccagggcatccccgacttcttcaagcagtccttccctg agggcttcacatgggagagagtcaccacatacgaagatgggggcgtgctgaccgctacccaggacac cagcctccaggacggctgcctcatctacaacgtcaagatcagaggggtgaacttcacatccaacggcc ctgtgatgcagaagaaaacactcggctgggaggccttcaccgagacgctgtaccccgctgacggcggc ctggaaggcagaaacgacatggccctgaagctcgtgggcgggagccatctgatcgcaaacgccaag accacatatagatccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcctggcatctactatgtggactacaga ctggaaagaatcaaggaggccaacaacgaaacctacgtcgagcagcacgaggtggcagtggccag atactgcgacctccctagcaaactggggcacaagcttaatccaaagaaaaagcggaaagtgtgagtcg acctcgagggggggcccggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccacatgt catcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagc ttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttg tggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggaattcacatgtgagcaaaaggccagcaaaagg ccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcaca aaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccct ggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggg aagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggt
atctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggc tgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaaccc ggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtag gcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgc gctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctg gtagcggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatctt ttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaa ggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggt ctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcct gactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgatacc gcgagaaccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcg cagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagt tcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatg gcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcac tgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctg agaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatag cagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgtt gagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctg ggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttg aatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttga atgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc (seq id no.103)
[0242]
plh-aaaa
[0243]
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[0245]
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技术特征：
1.一种基因先导编辑系统，包含载体，所述载体含有编码pegrna的基因以及编码融合蛋白的基因，其特征在于，所述pegrna包含sgrna、逆转录模板rtt、主要结合位点pbs和rna茎环结构；所述融合蛋白为cas9切口酶或其变体与逆转录酶的融合蛋白。2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述rna茎环结构选自以下至少一项：1)序列分别如seq id no.1～4所示的ms2、pp7、combs或csy4bs；2)在1)的5
′
端和/或3
′
端添加一个或几个核苷酸得到的rna序列；3)与1)或2)的rna序列具有85％以上的同一性的rna序列。3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，选自以下至少一项：1)所述rna茎环结构连接于所述主要结合位点pbs的3’端；2)所述pegrna为rna分子，从5’端至3’端依次为sgrna、逆转录模板rtt、主要结合位点pbs和rna茎环结构；3)所述融合蛋白还含有rna结合蛋白rbp；所述rbp为特异性结合rna茎环结构的蛋白；所述rbp为一个或多个；4)所述融合蛋白还含有rna结合蛋白rbp；所述融合蛋白由n端至c端依次包括rbp、cas9或其变体、逆转录酶；5)所述载体为一个或多个；6)所述编码pegrna的基因或编码融合蛋白的基因为一个或多个；7)所述编码pegrna的基因或编码融合蛋白的基因位于同一载体或不同载体上。4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，选自以下任一项：1)所述rbp选自tdmcp、tdpcp、com、csy4h29a中的任一种；2)所述cas9切口酶为h840a；3)所述逆转录酶为mmlv；4)所述系统还含有筛选标记蛋白。5.一种pegrna，其特征在于，所述pegrna为权利要求1～4任一项所述的系统中所述的pegrna。6.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为权利要求1～4任一项所述的系统中所述的融合蛋白。7.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求5所述的pegrna和/或如权利要求6所述的融合蛋白。8.一种构建体，所述构建体含有如权利要求7所述的核酸。9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求8所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求7所述的核酸。10.根据权利要求1-4任一项所述的系统或权利要求5所述的pegrna或权利要求6所述的融合蛋白或权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的构建体或权利要求9所述的宿主细胞的以下至少一项应用：1)用于生物体或生物细胞基因组序列的编辑；优选地，用于碱基替换；2)用于制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；3)用于提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；4)用于制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，用于dna编辑或rna编辑；优选地，用于dna编辑；进一步优选地，用于srd5a3，dyrk1a，hdac1，bcl11a，gfap，runx1，jak2，srd5a1，dmd和eed位点的编辑；更进一步优选地，用于srd5a3_+2c
·
g到a
·
t，dyrk1a_+1c
·
g到g
·
c，hdac1_+1c
·
g到g
·
c，bcl11a_+1c
·
g到a
·
t，gfap_+1a
·
t到t
·
a，runx1_+5g
·
c到t
·
a，jak2_+1c
·
g到t
·
a，srd5a1_+1c
·
g到a
·
t，dmd_+1t
·
a到c
·
g和eed_+1a
·
t到t
·
a的编辑。12.一种基因编辑的方法，包括将权利要求1-4任一项所述的系统或权利要求5所述的pegrna或权利要求6所述的融合蛋白或权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的构建体或权利要求9所述的宿主细胞导入待编辑体中实现基因的编辑。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，公开了一种基因先导编辑系统，包含载体，所述载体含有编码pegRNA的基因以及编码融合蛋白的基因，所述pegRNA包含sgRNA、逆转录模板RTT、主要结合位点PBS和RNA茎环结构；所述融合蛋白为Cas9切口酶或其变体与逆转录酶的融合蛋白。本发明采用通过在pegRNA的3'末端加入RNA颈环结构开发了sPEs,通过让pegRNA的3'末端结合到Cas9，开发了tPEs，以此来提高Cas9/pegRNA复合物的稳定性，进一步的提高在不同细胞中不同基因组位点的编辑效率。的编辑效率。的编辑效率。


技术研发人员：马涵慧 冯颖 刘思远
受保护的技术使用者：上海科技大学
技术研发日：2022.01.30
技术公布日：2023/8/8