一种miR-29b-3p的应用的制作方法

一种mir-29b-3p的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种mir-29b-3p的应用。


背景技术：

2.2型糖尿病是心力衰竭诱发因素，根据最新的心力衰竭共识及调查显示，约50％的慢性心力衰竭患者同时患有糖尿病，而发生心力衰竭的糖尿病患者的死亡率较无心力衰竭的糖尿病患者显著升高；临床研究发现，有一部分糖尿病患者即使在冠状动脉状态和血压正常的情况下，仍会因心力衰竭而死亡；既往弗雷明翰心脏研究报告提示，在校正了肥胖、血脂异常、高血压或冠状动脉疾病后，糖尿病患者的心力衰竭发生率仍明显增加；这种不能用高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病及其他心脏病变来解释的心脏功能障碍，被称为糖尿病心肌病(dcm)。dcm是糖尿病患者的一种慢性、不可逆的心脏并发症，其特征表现包括早期左室舒张功能障碍、心脏肥大，后期出现心室扩张、收缩功能障碍，最终导致心力衰竭。既往研究显示，糖尿病及糖尿病前期患者中dcm的患病率约为50％。目前dcm分为三个不同的临床阶段：无症状、舒张功能障碍和收缩功能障碍阶段。dcm往往在确诊前表现出一个极长的亚临床期，容易被临床医生忽视，从而导致早期诊断困难。并且，目前临床上仍缺乏针对dcm的有效治疗药物。因此，研究dcm的发病机制及寻找治疗靶点具有重要的理论意义和临床应用价值。
3.至今为止，既往研究已经发现部分micrornas及其靶向mrnas在dcm或糖尿病合并心力衰竭的心脏组织中发生了特异改变。microrna是一种小而高度保守的非编码基因小rna分子，心脏microrna是最近发现的心脏基因表达的关键调节剂，开发microrna拮抗剂和microrna模拟物治疗心肌病是当前非常活跃的一个研究领域。近来有研究发现，microrna拮抗剂在心力衰竭的治疗中取得了显著成功，表明microrna拮抗剂和microrna模拟物有可能成为未来预防和治疗dcm的潜在途径。近年来，关于mir-29b参与糖尿病慢性并发症发病的研究已有少量报道。例如，肾脏mir-29b的缺失与进行性糖尿病肾损伤有关，包括微量白蛋白尿、肾纤维化和炎症。mir-29b在2型糖尿病小鼠主动脉及高糖培养下的人主动脉平滑肌细胞中显著下调，并且抑制mir-29b可以增加ⅰ型胶原α1链和基质金属蛋白酶2的表达从而诱导主动脉病变中膜纤维化和弹性蛋白分解使主动脉硬度增加，但mir-29b-3p在dcm的作用尚无报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种mir-29b-3p的应用。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
6.本发明的第一方面是提供诱导mir-29b-3p表达的试剂在制备抑制肌纤维膜结合蛋白表达的试剂中的应用。
7.优选地，所述mir-29b-3p为心肌mir-29b-3p。
8.优选地，所述mir-29b-3p的序列如seq id no:1(hsa-mir-29b-3p：
uagcaccauuugaaaucaguguu)所示。
9.本发明的第二方面是提供诱导mir-29b-3p表达的试剂在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。
10.优选地，所述mir-29b-3p为心肌mir-29b-3p。
11.优选地，所述mir-29b-3p的序列如seq id no:1(hsa-mir-29b-3p：uagcaccauuugaaaucaguguu)所示。
12.本发明的第三方面是提供抑制肌纤维膜结合蛋白(slmap)表达的试剂在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。
13.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
14.本发明中mir-29b-3p可以调控slmap表达；mir-29b-3p及靶基因slmap可以作为糖尿病心肌病的药物治疗靶点。
附图说明
15.图1为dcm小鼠模型及胰高血糖素样肽-1受体激动剂(glp-1ra)治疗dcm小鼠的血糖变化。
16.图2为小鼠心脏进行he染色、油红o染色、天狼星红染色示意图。
17.图3为小鼠血浆bnp水平示意图。
18.图4为小鼠心脏组织microrna表达示意图；其中，图4a为小鼠心脏组织mir-29b表达示意图；图4b为小鼠心脏组织mir-223表达示意图；图4c为小鼠心脏组织mir-378表达示意图；图4d为小鼠心脏组织mir-208表达示意图；图4e为小鼠心脏组织mir-1表达示意图；图4f为小鼠心脏组织mir-133表达示意图。
19.图5为小鼠心脏组织slmap mrna水平示意图。
20.图6为小鼠心脏组织cav1.2 mrna水平示意图。
21.图7为小鼠心脏组织slmap蛋白表达量示意图。
22.图8为h9c2细胞mir-29b-3p水平示意图。
23.图9为h9c2细胞slmap mrna水平示意图。
24.图10为h9c2细胞slmap蛋白表达量示意图。
25.图11为h9c2细胞mir-29b-3p mimic处理后slmap蛋白表达量示意图。
26.图12为h9c2细胞mir-29b-3p inhibitor处理后slmap蛋白表达量示意图。
27.图13为slmap质粒h17649示意图。
28.图14为slmap质粒h17650示意图。
29.图15为双荧光素酶报告基因示意图。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相
互组合。
32.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
33.实施例1
34.胰高血糖素样肽受体激动剂(glp-1ra)对dcm小鼠心功能及心脏结构的影响。
35.一、构建dcm小鼠模型，并用glp-1ra进行治疗：
36.将8周龄c57bl/6雄性小鼠随机分为control组、dcm组、glp-1ra组，每组12只。小鼠喂养于上海市同济大学沪北校区实验动物中心spf级环境中，每日光照12小时并保持温度21℃
±
4℃，湿度55％
±
20％，自由饮水、进食。适应性喂养持续1周后开始实验。control组全程普通饲料饲养，dcm组、glp-1ra组全程高脂饲料喂养。4周后control组小鼠予以腹腔注射10μl/g的柠檬酸钠缓冲液，dcm组、glp-1ra组小鼠均给予一次性腹腔注射1％stz 100mg/kg。此后每周所有小鼠在禁食12小时后进行体重测量，尾静脉采血通过强生血糖仪检测血糖。stz注射一周后两次空腹血糖大于等于11.1mmol/l作为t2dm造模成功标准。血糖稳定6周后，dcm组小鼠每周皮下注射1ml生理盐水，持续12周。glp-1ra组小鼠每周皮下注射艾塞那肽微球(0.01mg/g)，持续12周。
37.二、三组小鼠心脏组织he染色、天狼星红染色及油红o染色：
38.he染色：新鲜心脏组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出，依次进行脱水、透明、浸蜡，蜡块凝固后从包埋框中并修整，随后将蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。染色前石蜡切片脱蜡至水，脱蜡切片入苏木素染2分钟，自来水洗，1％的盐酸酒精溶液分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色2分钟。随后将切片依次放入：
①
95％乙醇2次，每次5分钟；
②
无水乙醇2次，每次5分钟；
③
二甲苯2次，每次5分钟，脱水透明。将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集。
39.天狼星染色：将脱蜡切片入天狼星红染液中染色8分钟，无水乙醇脱水2次，每次5分钟；二甲苯2次，每次5分钟，脱水透明。中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集。
40.油红o染色：新鲜组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出放于15％的蔗糖溶液内，放入4℃冰箱。脱水沉底后转入30％的蔗糖溶液内，继续置于4℃冰箱脱水沉底。组织周围滴上oct包埋剂，在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，oct变白变硬后即可进行切片，切片厚8μm-10μm。将组织贴于载玻片上。-20℃保存备用。将冰冻切片复温干燥10分钟；细胞爬片4％多聚甲醛固定15分钟，pbs漂洗3次，每次5分钟。入油红o溶液10分钟；细胞爬片破膜10分钟，pbs漂洗3次，每次5分钟，入油红o溶液37℃染色1.5小时。75％乙醇分化2秒，水洗1分钟。苏木素复染2分钟左右，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。甘油明胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。
41.三、小鼠超声心动图检查心结构和功能：
42.用2％异氟烷麻醉小鼠后将其放置于37℃的恒温垫上，保持小鼠自主呼吸并持续吸入异氟烷，使用脱毛膏脱干净胸部毛发。将小鼠心率控制在400次/min-500次/min，应用超高分辨率小动物超声影像系统及频率为21mhz-50mhz的高频探头，于胸骨旁左心室长轴切面以及胸骨旁左心室乳头肌水平短轴切面采集左心室二维图像情况。采集以下结构变量：心率、左室舒张末期和收缩末期内径、左室舒张末期和收缩末期容积、收缩期和舒张期的室间隔厚度、收缩期和舒张期的左室后壁厚度、左室短轴缩短率、射血分数和e/a比值。所得值均取连续5个心动周期的平均值。
43.四、测定心功能指标bnp
44.选用小鼠bnp elisa检测试剂盒，根据说明进行检测，具体如下。
45.准备5个ep管，分别加入150μl标准稀释液。在第一管中加入150μl标准品储备溶液(1200ng/l)，充分混匀。取第一管中150μl溶液转移至第二管中，充分混匀，以此类推。从而生成不同浓度标准品(包括600ng/l、300ng/l、150ng/l、75ng/l、37.5ng/l)。将50μl标准品或样品加入预涂抗体滴定板的适当孔中，轻轻混合。每个样品、标准品和空白品双复孔进行检测，37℃孵育45分钟。将20ml洗涤缓冲液浓缩液加入去离子水中至总量600ml，制备洗涤缓冲液。移除滴定板中液体，甩干，每孔加入洗涤缓冲液，静置30秒后取出，重复4次。各孔加入稀释的生物素化抗igg 50μl，37℃孵育30分钟。移除滴定板中液体，甩干，每孔加入洗涤缓冲液，静置30秒后取出，重复4次。各孔加链霉亲和素hrp 50μl，37℃下孵育15分钟。移除滴定板中液体，甩干，每孔加入洗涤缓冲液，静置30秒后取出，重复4次。先加入显色剂溶液a 50μl，再加入显色剂溶液b 50μl至各孔，37℃孵育15分钟。每孔加入停止溶液50μl，停止反应。在450nm处，15分钟内测定光密度(od)。平均每个标准品、对照品和样品的重复读数，减去空白孔平均标准光密度。通过绘制每个标准品在y轴上的平均吸光度与x轴上的浓度之比，构建一个标准曲线，并通过图上的点绘制一个最佳拟合曲线。根据最佳拟合曲线公式及样品光密度计算样品bnp浓度。
46.五、结果
47.如图1所示，入组时各组小鼠血糖、体重无显著差异。高脂喂养及stz处理6周后，dcm组、glp-1ra组小鼠的空腹血糖》11.1mmol/l，相较control组显著升高(p《0.05)，提示t2dm造模成功。glp-1ra治疗后，glp-1ra组空腹血糖显著低于dcm组(p《0.05)，与control组无明显差异。
48.如图2所示，he染色可见与control组相比，dcm组的心肌细胞明显肥大，形态不规则，肌纤维紊乱，且胞浆内有较多大小不等的圆形脂滴空泡；glp-1ra组的上述心肌改变则得到了明显改善。油红o染色显示dcm组较control组胞浆内红染的圆形脂滴显著增多，glp-1ra较dcm组胞浆红染的圆形脂滴显著减少。天狼星红染色提示dcm组胶原沉积较control显著增加，而glp-1ra较dcm组胶原沉积显著减少。以上结果提示，dcm组小鼠心脏出现了特殊的心肌结构变化，包括心肌细胞肥大，脂质沉积增多和心肌间质纤维化的改变，提示dcm造模成功。同时，glp-1ra治疗可显著改善dcm组的心肌结构改变(包括心肌细胞肥大，心脏脂质沉积及心肌纤维化)。
49.如表1所示，与control组相比，dcm组左室舒张末期内径和容积、左室收缩末期内径和容积以及e/a均显著减少，而在glp-1ra治疗后，上述心超指标均得到了显著改善；而射血分数、左室短轴缩短率等收缩功能在三组之间则无明显差异。上述结果提示dcm小鼠出现了舒张功能障碍的表现，并且glp-1ra可以部分逆转上述改变。
50.表1：小鼠心超检查结果
[0051][0052][0053]
注：与control组相比，*p《0.05；与dcm组相比，#p《0.05。
[0054]
如图3所示，dcm组血浆bnp水平较control组显著升高，在给予glp-1ra治疗后，bnp水平较dcm组明显降低。
[0055]
实施例2
[0056]
glp-1ra对dcm小鼠心脏组织microrna、mrna、蛋白质表达的影响。
[0057]
本实施例中下述mir-29b序列如seq id no:2所示(mmu-mir-29b-3p：uagcaccauuugaaaucaguguu)；其余鼠源性与人源性序列均高度保守，故后文中鼠源性序列所采用的引物序列与人源性序列所采用的引物序列完全相同。
[0058]
一、总rna抽提
[0059]
取50-100mg小鼠心脏组织加入1ml trizol试剂，用匀浆仪匀浆。或6孔板细胞每孔加入500μl trizol试剂，吹打。室温静置5分钟后，4℃转速12000g离心10分钟，转移上清至无rna酶的ep管中；加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒混匀，室温静置3分钟后，4℃转速12000g离心15分钟；将上层水相移至另一ep管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟后，4℃转速12000g离心10分钟；弃去上清，在沉淀中加入1ml预冷75％乙醇颠倒混匀，4℃转速7500g离心5分钟，重复2次。洗涤结束，弃液体后将ep管倒置在无尘纸上空气干燥30分钟。加入20μl rnase free h2o，4℃溶解半小时。测定总rna的浓度和纯度，要求a260/a280比值在1.9-2.0之间。a260/a230比值大于2，且为单峰。
[0060]
二、应用poly(a)加尾法定量检测microrna
[0061]
将反应物及总rna放置于冰上，逆转录按以下体系加样。
[0062][0063]
加样后，在微型离心机中短暂离心混匀后，放入pcr仪中按以下条件进行逆转录：
[0064][0065]
cdna合成完毕后加90μl水稀释后作为模板进行qpcr反应。
[0066]
pcr引物序列详见下表：
[0067]
[0068][0069]
在冰上按下列组分配制microrna的pcr反应体系：
[0070][0071]
将反应体系加入384孔板中，放入实时荧光定量pcr仪中，两步法进行pcr扩增，扩增参数如下：
[0072][0073]
三、检测mrna表达
[0074]
采用takara的rna逆转录试剂盒进行mrna逆转录。将反应物及mrna放置于冰上，按以下体系加样：
[0075][0076]
放入pcr仪中按以下条件进行逆转录：
[0077][0078]
cdna合成完毕后加180μl水稀释后作为模板进行qpcr反应。
[0079]
用real-time pcr验证心脏组织的相关基因表达水平。pcr引物序列详见下表：
[0080]
[0081][0082]
在冰上按下列组分配制pcr反应体系：
[0083][0084]
将反应体系加入384孔板中，放入实时荧光定量pcr仪中，两步法进行pcr扩增，扩增参数如下：
[0085][0086]
四、slmap蛋白表达检测
[0087]
小鼠心脏组织块用冷pbs洗涤3次，剪成小块置于匀浆管中。加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液1ml置于均质匀浆机中，匀浆约60s。将匀浆完成的样本管冰浴30分钟，每隔5分钟震荡一次确保组织完全裂解。12000rpm离心10分钟，收集上清液，即为蛋白溶液。6孔
板细胞1000rpm离心5分钟后用pbs洗涤3遍，弃去pbs，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液1ml，冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解，4℃条件下12000rpm离心10分钟，提取上清液即为蛋白溶液。
[0088]
取0.8ml蛋白标准配制液加入20mg bsa中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。取20μl 25mg/ml的蛋白标准品溶液，加入980μl pbs稀释为0.5mg/ml的蛋白标准品。将标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl和20μl加入96孔板中，再加入pbs补足至总体积20μl，相当于标准品浓度分别为0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml和0.5mg/ml。加入4μl样品到96孔板中，pbs补至总体积20μl。各孔中加入200μl bca工作液，37℃放置30分钟，酶标仪560nm处检测od值。根据标准曲线计算每个样本的蛋白浓度。蛋白样品与蛋白上样缓冲液(6
×
)按照5：1比例混合，100℃加热10分钟，充分变性蛋白，-20℃储存。
[0089]
配制8％sds-page胶。在sds-page胶中加入蛋白marker 4μl或含20μg总蛋白的样品，80v电泳30分钟后将电压调至100v继续电泳1小时。用甲醇活化后的pvdf膜覆盖凝胶，200a电泳1.5小时。转膜结束后将pvdf膜用tbst洗涤3次，每次5分钟。后放入wb封闭液中封闭15分钟，tbst洗涤3次，每次5分钟。再放入1:1000稀释的一抗anti-slmap抗体或1:5000稀释的anti-gapdh抗体中4℃孵育过夜。第二天将pvdf膜取出，用tbst洗涤3次后，每次5分钟，洗涤后将膜放入二抗中室温孵育2小时。孵育结束后，用tbst洗涤3次，每次5分钟。洗涤结束后超敏ecl化学发光工作液显影。
[0090]
五、结果
[0091]
如图4所示，与control组相比，dcm组小鼠心脏microrna表达发生了特异改变，而glp-1ra可以影响dcm小鼠心脏中microrna的表达。mir-29b、mir-223、mir-378、mir-208在dcm组小鼠心肌的表达较control组明显下降，dcm组mir-1较control组显著增高；而glp-1ra可以逆转dcm导致的上述microrna变化。此外，mir-133在dcm组小鼠心肌的表达较control组明显下降，而glp-1ra组则与dcm组无差异。通过生物信息学工具对上述发生了差异表达的microrna的下游靶点进行预测后发现了microrna-29b有可能调控slmap的表达。
[0092]
如图5所示，dcm组小鼠心脏中slmap mrna表达较control组显著增加，而glp-1ra组slmap mrna则较dcm组明显减少。
[0093]
如图7所示，与control组相比，dcm组小鼠心脏中slmap各亚型：slmap1、slmap2、slmap3均显著增加，glp-1ra治疗可逆转dcm导致的slmap各亚型的变化。
[0094]
如图6所示，dcm组小鼠心肌cav1.2的基因表达较control组明显降低，glp-1ra治疗则可显著升高dcm小鼠心肌cav1.2表达。
[0095]
上述结果提示dcm组小鼠心肌中microrna-29b及预测的靶点slmap均发生了显著变化，并且心肌钙通道重要基因也发生了显著改变；在glp-1ra治疗后，dcm小鼠心脏中的上述改变均得到了逆转。
[0096]
实施例3
[0097]
glp-1ra对高糖高脂刺激的h9c2细胞中microrna、mrna、蛋白质的表达的影响。
[0098]
一、glp-1ra处理高糖高脂刺激h9c2细胞
[0099]
当6cm培养皿中h9c2细胞增长至80％汇聚时，按上述传代方法1：3传于3块6孔板中，待增长至80％汇聚时，无血清培养液饥饿过夜。control组换用葡萄糖终浓度为
5.5mmol/l的dmem培养液(低糖型)；高糖高脂组(high glucose/ffa)培养液葡萄糖终浓度为30mmol/l，ffa浓度为1mmol/l；glp-1ra组培养液葡萄糖终浓度为30mmol/l，ffa终浓度为1mmol/l，艾塞那肽终浓度为200nmol/l，24小时换液，培养48小时后收集细胞做后续pcr、western blot检测。
[0100]
二、microrna、mrna、蛋白质表达方法同实施例2。
[0101]
三、结果
[0102]
如图8所示，高糖高脂培养下h9c2心肌细胞mir-29b表达较control组显著降低，如图9-10所示，slmap mrna和蛋白水平均明显升高。如图8及图10所示，glp-1ra可逆转高糖高脂对h9c2细胞内mir-29b水平的影响，并且可以逆转高糖高脂导致的slmap蛋白水平升高(包括slmap1、slmap2、slmap3)。但glp-1ra对slmap mrna水平无明显作用。高糖高脂刺激h9c2细胞可以作为dcm的体外细胞模型，并且表现出与dcm小鼠模型中相似的mir-29b/slmap表达改变。glp-1ra对该细胞模型进行处理后，同样可以逆转高糖高脂诱发的mir-29b/slmap表达变化。
[0103]
实施例4
[0104]
mir-29b对slmap的调控作用测试
[0105]
(1)h9c2细胞转染mir-29b mimic或者mir-29b inhibitor
[0106]
当细胞在6孔板培养至70-90％时转染。在125μl opti-mem培养基中加入3.75μl lipofectamine3000试剂，充分混匀。使用opti-mem培养基125μl分别稀释100pmol mir-29b mimic(seq id no:22：5
’‑
uagcaccauuugaaaucaguguu-3’，seq id no:23：5
’‑
cacugauuucaaauggugcuauu-3’)、mir-29b mimic control(seq id no:24：5
’‑
uucuccgaacgugucacgutt-3’，seq id no:25：5
’‑
acgugacacguucggagaatt-3’)、mir-29b inhibitor(seq id no:26：5
’‑
aacacugauuucaaauggugcua-3’)和mir-29b inhibitor control(seq id no:27：5
’‑
caguacuuuuguguaguacaa-3’)。在已稀释的125μl lipofectamine 3000试剂中分别加入125μl稀释的mir-29b mimic、mir-29b mimic control、mir-29b inhibitor或mir-29b inhibitor control，室温孵育5分钟后加入至细胞中。37℃孵育细胞3天。然后收集转染细胞，做后续pcr、western blot检测。
[0107]
(2)microrna、mrna、蛋白质表达的检测方法同实施例2。
[0108]
(3)mir-29b与靶基因slmap 3'utr的结合位点预测
[0109]
mir-29b序列：uagcaccauuugaaaucaguguu。选择nm_001304420.2作为靶基因slmap的转录本。
[0110]
(4)预测结合位点并设计突变
[0111]
通过targetscan：mirna靶基因数据库，预测到1个7mer-a1的结合位点：aggtgcta。设计slmap 3'utr突变型：aggtgcta突变成cacgaaat。
[0112]
(5)构建slmap 3'utr质粒h17649和slmap 3'utr突变质粒h17650(图13及图14)。
[0113]
(6)用上述质粒转染工具细胞
[0114]
mek293t细胞按70％汇合度接种到96孔板，24小时后开始转染，每个组设置6个复孔。每孔的萤火虫萤光素酶载体(firefly)，海肾萤光素酶载体(renilla)和转染试剂按0.2μg：0.01μg：0.25μl混合配制dna转染混合液。
[0115]
配制mir-29b mimic转染混合液：mir-29b mimic的终浓度为100nm，转染试剂每孔
25μl。常温孵育20分钟。每孔弃去50μl培养基，将上述25μl dna转染混合液和25μl mir-29b mimic转染混合液添加到每孔细胞样品中。6小时后换新鲜培养基。
[0116]
(7)双荧光素酶报告基因检测
[0117]
质粒共转染48小时后，弃去培养基，用100μl pbs洗1遍，吸去pbs。去离子水将5
×
plb(passive lysis buffer)稀释成1
×
plb，使用前放到常温。每孔加100μl稀释好的1
×
plb，常温摇床下摇15分钟，进行裂解。96孔酶标板中每孔加裂解后的上清液5μl，加入50μl预先混好的lar ii，2s后测firefly luciferase数据。每孔添加50μl stop&glo reagent，静止2s后，测renialla luciferase数据。firefly luciferase的数据除以renialla luciferase的数据，用归一后的平均值做图。
[0118]
结果如下：如图11所示，mir-29b mimic可升高h9c2心肌细胞内mir-29b水平，同时slmap蛋白水平(包括slmap1、slmap2、slmap3)均较control组显著降低。
[0119]
如图12所示，用mir-29b inhibitor显著抑制h9c2心肌细胞内mir-29b水平后，slmap蛋白水平(包括slmap1、slmap2、slmap3)均较control组显著增加。
[0120]
如图15所示，双荧光素酶报告基因结果表明，与control组相比，mir-29b mimics可显著抑制slmap 3'utr的荧光表达；而在结合位点突变后，则显著减少了mir-29b mimics对slmap 3'utr荧光的抑制作用。提示mir-29b可以调控下游slmap表达，并且是通过该结合位点调控slmap的表达。
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综上所述，本发明证实了dcm小鼠模型出现了心功能不全、心肌纤维化及心脏脂质沉积，glp-1ra可以显著改善dcm小鼠的上述心脏结构和功能异常。与此同时，与control组相比，dcm小鼠模型心肌组织及高糖高脂刺激后的体外心肌细胞模型中均可见mir-29b-3p降低及slmap的升高；而glp-1ra治疗可以显著升高dcm小鼠心肌及体外心肌细胞模型中的mir-29b-3p，并降低slmap水平，mir-29b-3p可以调控slmap表达。
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以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.诱导mir-29b-3p表达的试剂在制备抑制肌纤维膜结合蛋白表达的试剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-29b-3p为心肌mir-29b-3p。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-29b-3p的序列如seq id no:1所示。4.诱导mir-29b-3p表达的试剂在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述mir-29b-3p为心肌mir-29b-3p。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述mir-29b-3p的序列如seq id no:1所示。7.抑制肌纤维膜结合蛋白表达的试剂在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。

技术总结
本发明涉及诱导miR-29b-3p表达的试剂在制备抑制肌纤维膜结合蛋白(SLMAP)表达的试剂中的应用；本发明还涉及诱导miR-29b-3p表达的试剂在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用；本发明中miR-29b-3p可以调控SLMAP表达；miR-29b-3p及靶基因SLMAP可以作为糖尿病心肌病的药物治疗靶点。药物治疗靶点。药物治疗靶点。


技术研发人员：方萍 薛莹 叶正芹 张克勤 李然 周筠 李羚 宗冠男 胡珂榕 徐威
受保护的技术使用者：上海市同济医院
技术研发日：2022.08.05
技术公布日：2023/8/9