增强胞苷生产的方法及应用与流程

1.本发明涉及增强胞苷生产的方法及应用，属于基因工程和微生物工程领域。


背景技术：

2.1-β-d-呋喃核苷胞嘧啶(1-beta-ribofuranosylcytosine)又名胞嘧啶核苷(cytosine nucleoside)、胞苷(cytidine)。胞苷是由胞嘧啶的n-1与d-核糖的c-1通过β糖苷键相连接形成的化合物。胞苷存在于一切生物体内，是rna的组成部分。胞苷最重要的工业用途是作为化学合成抗病毒、抗肿瘤药物的原料。许多胞苷结构类似物，都具有干扰细胞rna合成的作用。基于这一原理，已开发出了多种胞苷类似物，用于治疗病毒感染和肿瘤，其中许多药物被作为临床特效药和首选药物而广泛使用。例如：扎西他滨(2'，3'-双脱氧胞嘧啶核苷)，能够竞争性的抑制逆转录酶活性，被广泛用于治疗hiv感染和其它逆转录病毒感染。卡培他滨(5'-脱氧-5-氟-n-[(戊氧基)羰基]胞苷)，也是一种胞苷类似物，在临床上用于治疗肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤。这些胞苷结构类似物都是重要的临床药物，都是以胞苷为原料，通过化学合成生产。因此，胞苷是重要的医药中间体。
[0003]
目前为止，胞苷的工业生产方法包括rna水解法、化学合成法和微生物发酵法三种。rna水解法生产胞苷虽然有技术简单、容易操作和控制等优点，但是对原料要求较高，工艺过程复杂，产品收率低，生产成本过高，目前已基本被其它方法所替代。已开发出了数十种化学合成法生产胞苷的工艺技术，最新的胞苷合成工艺是用双对硝基酚磷酸酯为催化剂，催化n4-乙酰胞嘧啶和四-o-乙酰基-β-d-呋喃核糖反应，经脱除乙酰基，生成胞苷。化学合成法生产胞苷的技术发展至今，显著降低了胞苷的价格。但是，化学合成法固有的反应路线长、反应条件苛刻、催化剂价格昂贵、副产品多以及潜在的环境污染等特点所限，进一步降低生产成本几乎不可能。由于胞苷生产成本的问题，限制了其在医药领域和其它用途的应用。
[0004]
微生物发酵法生产胞苷包括添加前体物发酵法和直接发酵法。添加前体物发酵法生产胞苷主要是利用胞苷合成的补救途径，胞苷合成的补救途径是指培养基中补加的尿嘧啶与微生物细胞内的5-磷酸核糖焦磷酸(prpp)，在尿嘧啶核糖磷酸转移酶(pyrr/upp)的催化下直接生成ump，然后经过udp、utp、ctp生成胞苷。直接发酵法胞苷，主要是利用微生物的ump的“从无到有”生成ump，然后再经udp、utp、ctp生成胞苷。利用微生物的补救途径发酵生产胞苷，需要尿嘧啶作为发酵的前体物，造成原料成本高，生产效率低，不是技术发展的方向。而直接发酵法可通过微生物遗传育种技术，选育高产胞苷的发酵菌种，以葡萄糖为主要原料，在温和的条件下，经过相对简单的工艺，生产高质量的胞苷。直接发酵法能够进一步降低胞苷的生产成本，生产过程相对环境友好，技术提升空间较大。
[0005]
cn106754602a披露了一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法，敲除了胞苷脱氨酶、核糖核苷水解酶、胞苷/尿苷激酶、核苷转运蛋白，同时过量表达了胞苷三磷酸焦磷酸化酶、胞苷单磷酸磷酸化酶，解除嘧啶核苷途径的反馈抑制，构建了一株重组大肠杆菌，其在5l发酵罐可达20g/l的胞苷生产水平。但该方法构建的菌株在发酵时需要添加抗生素，
且在发酵生产胞苷时，需要添加诱导剂iptg，且产量不高。该诱导剂和抗生素价格昂贵且对细胞有毒性，同时如果胞苷的积累浓度进一步获得提高，将进一步促进其工业化生产。


技术实现要素：

[0006]
本发明要解决的技术问题是现有技术中缺少可高产胞苷的重组菌株，特别是缺少在不添加诱导剂和抗生素的条件下高产胞苷的重组菌株。
[0007]
本发明提供了一种重组大肠杆菌，敲除了基因组上的胞苷脱氨酶基因cdd、尿苷激酶基因udk、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb、核苷酸5
’‑
单磷酸核苷酶基因ppnn、丙酮酸氧化酶基因poxb和核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdd，并整合表达5
’‑
ctp二磷酸水解酶和/或乳清酸磷酸核糖转移酶。
[0008]
在一种实施方式中，所述胞苷脱氨酶基因cdd的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述尿苷激酶基因udk的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述核苷酸5
’‑
单磷酸核苷酶基因ppnn的核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0009]
在一种实施方式中，所述5
’‑
ctp二磷酸水解酶具有seq id no.6所示的氨基酸序列。
[0010]
在一种实施方式中，所述乳清酸磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如seq id no.8或seq id no.10所示。
[0011]
在一种实施方式中，在umph位点整合5
’‑
ctp二磷酸水解酶基因；所述5
’‑
ctp二磷酸水解酶的基因序列如seq id no.5所示。
[0012]
在一种实施方式中，在umph位点整合乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyre和/或pyre/k26h；所述乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyre的基因序列如seq id no.7所示；所述pyre/k26h的基因序列如seq id no.9所示。
[0013]
在一种实施方式中，所述丙酮酸氧化酶基因poxb的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述的核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdd如seq id no.18。
[0014]
在一种实施方式中，所述的重组大肠杆菌在丙酮酸氧化酶基因poxb所在位置还整合表达了尿苷酸激酶突变体基因pyrh(r92g/d93g)。
[0015]
在一种实施方式中，所述尿苷酸激酶突变体pyrh(r92g/d93g)具有seq id no.14所示的氨基酸序列，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.15所示。
[0016]
在一种实施方式中，所述的重组大肠杆菌在核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdd所在位置整合表达磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因gnd。
[0017]
在一种实施方式中，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因gnd采用串联表达；所述prs与zwf之间含有rbs序列agga；所述zwf与gnd之间含有rbs序列agga，串联顺序为zwf-rbs-gnd-rbs-prs。
[0018]
在一种实施方式中，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的核苷酸序列如seq id no.20所示，所述6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因gnd的核苷酸序列如seq id no.21所示。
[0019]
本发明还提供增强胞苷生产的方法及应用，是敲除大肠杆菌基因组上的丙酮酸氧
化酶基因poxb和核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdd，整合表达尿苷酸激酶突变体基因pyrh(r92g/d93g)，整合表达磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因gnd，促进胞苷高效积累。
[0020]
在一种实施方式中，所述大肠杆菌选自：dh5α、bl21(de3)、jm109、hb101或mg1655。
[0021]
本发明还提供一种发酵生产胞苷的方法，是将所述重组大肠杆菌在含葡萄糖的培养基中发酵。
[0022]
在一种实施方式中，所述发酵过程不添加任何抗生素和诱导剂(iptg)。
[0023]
在一种实施方式中，所述发酵是将菌株接种至lb培养基中，37℃和200rpm，培养5-15h；对于摇瓶发酵，按照0.1-10％接种量接种至含有50-150ml lb培养基的500ml三角瓶中，37℃和200rpm，培养40-75h。
[0024]
在一种实施方式中，所述发酵是将lb培养基中的种子液按照0.5-15％接种量，转接至发酵培养基中，在35℃和200rpm条件下进行发酵培养，控制发酵过程中葡萄糖浓度为15
±
2g/l，控制溶氧为25％；当溶氧低于25％，提高搅拌转速、通气量和罐压；发酵过程采用氨水控制ph为6-8。
[0025]
在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有：葡萄糖12-85g/l、mgso
4 0.5-5g/l、柠檬酸钠1.6-19mg/l、氯化钙7-560mg/l、磷酸氢二钠0.1-7.9g/l、磷酸二氢钠0.6-10.3g/l、氯化锌0.7-72mg/l、酵母粉0.3-11g/l、蛋白胨0.5-21g/l、氯化铜5-145mg/l、硫酸锌1-9.2mg/l、钼酸钠1.3-165mg/l。
[0026]
在一种实施方式中，发酵过程还进行补料；所述补料培养基含有：葡萄糖350-820g/l、蛋白胨0.5-20g/l、酵母粉0.5-20g/l。
[0027]
本发明还提供所述重组大肠杆菌在发酵生产胞苷方面的应用。
[0028]
有益效果：
[0029]
(1)本发明采用基因敲除技术整合表达尿苷酸激酶突变体基因pyrh(r92g/d93g)弱化胞苷前体物5
’‑
cmp合成途径中的限速步骤并敲除丙酮酸氧化酶基因poxb增强前体物质丙酮酸的积累，整合表达磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因gnd提高ppp途径的碳通量增强前体物质prpp的供应并敲除核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdd阻断ctp至dctp的通量，可以高效生产胞苷。在30l发酵罐中产量达到61.9g/l，基本不积累中间代谢产物，有利于胞苷的分离纯化。
[0030]
(2)本发明提供的重组大肠杆菌，能够以葡萄糖为底物，在不补加诱导剂iptg和抗生素的条件下，一步发酵得到胞苷，发酵上清液中胞苷浓度高，便于分离纯化，工艺简单。
附图说明
[0031]
图1为胞苷代谢途径示意图；
[0032]
图2为不同重组菌株的胞苷生产水平(摇瓶)；
[0033]
图3为ppp代谢途径示意图；
[0034]
图4为重组菌株e.coli cr09产胞苷曲线图(30l发酵罐)；
[0035]
图5为重组菌株e.coli cr09产胞苷的hplc图。
具体实施方式
[0036]
表1具体实施方式中涉及的菌株：
[0037][0038][0039]
胞苷的hplc检测条件：液相色谱仪岛津10a，色谱柱：inertsil ods-sp 5μm 4.6*250mm，流动相：磷酸盐缓冲液：乙腈＝97:3，磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钠1.884g，磷酸二氢钠0.726g加水1l，加30.9ml乙腈。柱温：35度，波长：260nm，流速：1.0ml/min。
[0040]
构建重组菌株所需要的引物序列：
[0041]
表2所用的引物序列
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046][0047]
重组质粒的构建：对于构建敲除或整合基因时所用质粒如下：1)采用引物sg-ppnn-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-ppnn。2)采用引物petac-pyre-fw和petac-pyre-rs，构建获得质粒petac-pyre。3)采用引物petac-nudg-fw和petac-nudg-rs，构建获得质粒petac-nudg。4)基因udk，采用sg-udk-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-udk。5)基因umph，采用引物sg-umph-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-umph。6)基因umpg，采用引物sg-umpg-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-umpg。7)基因cdd，采用引物sg-cdd-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-cdd。8)rihb：用引物sg-rihb-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-rihb。9)采用引物petac-pyrh-fw和petac-pyrh-rs，构建获得质粒petac-pyrh。10)采用引物petac-ppp-fw和petac-ppp-rs，构建获得质粒petac-ppp。11)基因poxb，采用引物sg-poxb-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-poxb。12)基因nrdd，采用引物sg-nrdd-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-nrdd。
[0048]
基因敲除：采用crispr cas9基因编辑技术，敲除e.coli mg1655基因组上分解5
’‑
cmp代谢途径的基因，以ppnn基因敲除为例。根据ncbi中e.coli mg1655的ppnn基因序列设计引物(表1)，pcr扩增敲除框上游同源臂基因片段ppnn-up和下游同源臂基因片段ppnn-down。其中，ppnn-up和ppnn-down有40bp的重叠区域，同时以ppnn-up和ppnn-down为模板进
行融合pcr，获得敲除ppnn基因的敲除框ppnn-g1。
[0049]
以ptargetf质粒为模板，利用引物sg-ppnn-l、ptarget-r进行全质粒pcr，纯化片段。利用限制性内切酶dpnⅰ对质粒模板消化处理后，转入e.coli jm109中，涂布到含有壮观霉素的lb平板上，37℃培养12h。挑平板上的单菌落至10ml lb培养基中培养8h，提质粒并测序验证。
[0050]
将已构建的敲除框ppnn-g1和质粒ptargetf-ppnn(sgrna质粒)转入含有质粒的e.coli mg1655 pcas中，30℃培养2h。涂布于含有壮观霉素抗性和卡那霉素抗性的lb平板上，30℃培养。利用引物δppnn-pcr-fw、δppnn-pcr-rs对单菌落进行菌落pcr，阳性克隆的pcr产物大小为1279bp。基因组上原有片段pcr产物大小为1579bp，说明基因敲除成功，同时进行测序验证。
[0051]
挑取阳性转化子，在含有iptg(终浓度是1mm)的lb培养基中培养2h，取100μl培养液涂布到含有卡那霉素的lb平板上，30℃培养以消除ptargetf-ppnn质粒。单菌落长出后，将单菌落同时转接到含有卡那霉素的lb平板、含有壮观霉素和卡那霉素的lb平板上，挑选在卡那霉素抗性培养基上长，但在壮观霉素抗性和卡那霉素抗性的培养基上不长的菌落，即为消除ptargetf-ppnn质粒的克隆。
[0052]
挑取已消除ptargetf-ppnn质粒的克隆在含有卡那霉素抗性的lb平板上划线，放30℃培养12h。挑取单菌落在lb平板上划线，42℃培养12h。单菌落长出后，将单菌落同时转接到卡那霉素lb平板和无抗性的lb平板上，挑选在卡那霉素抗性平板上不长，但在无抗性的lb平板上长的克隆，命名为e.coli cr04(已消除pcas质粒)。以同样的方法获得其它基因敲除的重组菌株。
[0053]
乳清酸磷酸核糖转移酶pyre酶活力测定：反应混合物(150μl)含有20mm tris-hcl、ph 7.6,2mm氯化镁、100μm prpp，20μl酶和50μm乳清酸盐。该酶与除prpp外的所有成分一起孵育1min。加入100μm prpp开始反应，反应2min，测定乳清酸盐的消耗量。酶活力定义单位：在上述反应条件下每分钟消耗1μmol乳清酸盐的量为一个酶活力单位(u)。摇瓶发酵方法：将菌株接种至lb培养基中，37℃和200rpm，培养8h；对于摇瓶发酵，按照1％接种量接种至含有100ml lb培养基的500ml三角瓶中，37℃和200rpm，培养60h。
[0054]
30l发酵罐发酵培养基为：葡萄糖12-85g/l、mgso
4 0.5-5g/l、柠檬酸钠1.6-19mg/l、氯化钙7-560mg/l、磷酸氢二钠0.1-7.9g/l、磷酸二氢钠0.6-10.3g/l、氯化锌0.7-72mg/l、酵母粉0.3-11g/l、蛋白胨0.5-21g/l、氯化铜5-145mg/l、硫酸锌1-9.2mg/l、钼酸钠1.3-165mg/l)。补料培养基：葡萄糖350-820g/l、蛋白胨0.5-20g/l、酵母粉0.5-20g/l。
[0055]
30l发酵罐发酵：将lb培养基中的种子液按照0.5-15％接种量，转接至发酵培养基中(30l发酵罐，初始装液量为12l)，在35℃和200rpm条件下进行发酵培养，通过测定发酵液中葡萄糖控制葡萄糖浓度为15
±
2g/l；控制溶氧为25％，当低于25％，提高搅拌转速、通气量和罐压。采用氨水控制ph为6-8。发酵结束后，离心除菌体，取上清液，采用hplc测定其中胞苷的含量。
[0056]
实施例1：阻断胞苷及其前体cmp降解途径提高胞苷积累水平
[0057]
为实现胞苷的积累，阻断胞苷的降解，构建敲除质粒ptargetf-cdd，对菌株e.coli mg1655敲除胞苷脱氨酶基因cdd获得重组菌株e.coli cr01。将菌株接种至lb培养基中，37℃和200rpm，培养8h；对于摇瓶发酵，按照1％接种量接种至含有100ml lb培养基的500ml三
角瓶中，37℃和200rpm，培养60h。如图2所示，在发酵60h时e.coli cr01的胞苷产量可达60.2mg/l(摇瓶水平)，相较于对照菌株e.coli mg1655的胞苷产量显著提高。说明敲除胞苷脱氨酶基因cdd，阻断胞苷流向尿苷和尿嘧啶的嘧啶代谢通量，对提高胞苷积累具有积极影响。
[0058]
为实现胞苷的积累，阻断胞苷至cmp的转化途径，构建敲除质粒ptargetf-udk，敲除菌株e.coli cr01尿苷/胞嘧啶核苷激酶基因udk获得重组菌株e.coli cr02。将菌株接种至lb培养基中，37℃和200rpm，培养8h；对于摇瓶发酵，按照1％接种量接种至含有100ml lb培养基的500ml三角瓶中，37℃和200rpm，培养60h。如图2所示，在发酵60h时e.coli cr02的胞苷产量可达110.1mg/l(摇瓶水平)，相较于对照菌株e.coli cr01的胞苷产量显著提高。说明敲除尿苷/胞嘧啶核苷激酶基因udk，阻断胞苷流向cmp的嘧啶代谢通量，对提高胞苷积累具有积极影响。
[0059]
为实现胞苷的积累，阻断胞苷至cmp的转化途径，构建敲除质粒ptargetf-rihb，对菌株e.coli cr02敲除嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb获得重组菌株e.coli cr03。如图2所示，在发酵60h时e.coli cr03的胞苷产量可达310.6mg/l(摇瓶水平)，相较于对照菌株e.coli cr02的胞苷产量显著提高。说明敲除嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb，阻断胞苷流向cmp的嘧啶代谢通量，对提高胞苷积累具有积极影响。
[0060]
基因ppnn编码的核苷酸5
’‑
单磷酸核苷酶对胞苷在e.coli中的高效积累具有重要意义。为实现胞苷的积累，阻断胞苷至cmp的转化途径，构建敲除质粒ptargetf-ppnn，对菌株e.coli cr03进行嘧啶-5'-核苷酸核苷酶基因ppnn敲除，获得重组菌株e.coli cr04。如图2所示，在发酵60h时e.coli cr04的胞苷产量可达362.4mg/l(摇瓶水平)，相较于对照菌株e.coli cr03的胞苷产量显著提高。说明敲除嘧啶-5'-核苷酸核苷酶基因ppnn，阻断cmp流向胞嘧啶的代谢通量，对提高胞苷积累具有积极影响。
[0061]
实施例2：增强胞苷合成途径的代谢通量提高其积累水平
[0062]
以实施例1构建的重组菌株e.coli cr04为出发菌株，在基因组上基因位点umph上整合表达5
’‑
ctp二磷酸水解酶基因nudg，提高ctp到胞苷的代谢通量，构建获得重组菌株e.coli cr05。如图2所示，摇瓶水平发酵60h重组菌株e.coli cr05的胞苷的产量从菌株e.coli cr04的362.4mg/l提高至378.2mg/l。结果表明，整合表达nudg基因对提高e.coli中胞苷的积累具有积极作用。
[0063]
为进一步提高胞苷合成途径的代谢通量，研究中通过减少乳清酸的积累量提高胞苷的生产水平。在重组菌株e.coli cr05的基因组上基因umpg位点整合表达乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyre，构建获得重组菌株e.coli cr06。采用引物sg-umpg-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-umpg。采用引物δumpg::pyre/pyre/k26h-up-fw、δumpg::pyre/pyre/k26h-up-rs、δumpg::pyre/pyre/k26h-down-fw、δumpg::pyre/pyre/k26h-down-rs，以e.coli mg1655基因组为模板获得整合框上下游同源臂pyre-g1和pyre-g2，采用引物δumpg::pyre/pyre/k26h-mid-fw和δumpg::pyre/pyre/k26h-mid-rs，以质粒petac-pyre为模板获得表达框pyre-z。采用引物δumpg::pyre/pyre/k26h-up-fw和δumpg::pyre/pyre/k26h-down-rs，以pyre-g1、pyre-g2、pyre-z为模板进行融合pcr，获得donor dna片段。将ptargetf-umpg和donor dna导入含有pcas质粒的重组菌株e.coli cr05的电转感受态中，筛选获得整合pyre基因的重组菌株。消除质粒pcas
质粒和ptarget质粒，获得重组e.coli cr06。摇瓶水平发酵60h时，e.coli cr06的胞苷产量达396.5mg/l，相较于对照菌株e.coli cr05的胞苷产量显著提高(图2)。结果证明，基因组上乳清酸磷酸核糖转移酶基因umpg的整合表达，提高了胞苷合成途径的代谢通量，进一步提高了胞苷的生产水平。
[0064]
为进一步提高胞苷合成途径的代谢通量，通过减少乳清酸的积累量提高胞苷的生产水平。采用软件swiss model进行同源建模，构建获得pyre的三级结构。根据对pyre的三级结构进行生物信息学分析，发现氨基酸残基k26和h105形成了一个“碱性桥”。研究中，通过具有特异性及较短侧链的碱性氨基酸his替换第26位的碱性氨基酸lys，构建获得具有高酶活力的酶突变体pyre/k26h。采用质粒pet28a游离表达酶突变体pyre/k26h(连接用酶切位点为ecorⅰ、hind iii)，将菌株接种至lb培养基中，37℃和200rpm，培养8h；对于摇瓶发酵，按照1％接种量接种至含有100ml lb培养基的500ml三角瓶中，37℃和200rpm，培养60h。收集细胞，采用超声破碎处理后，离心取上清，镍柱纯化酶突变体pyre/k26h的比酶活力(0.13u/mg)相对于对照酶pyre(0.07u/mg)提高了82％。此外，还尝试将26位的碱性氨基酸lys替换成氨基酸gly时，突变体pyre/k26g(氨基酸序列如seq id no.12所示；核苷酸序列如seq id no.11所示)的比酶活力(0.026u/mg)降低显著，减低至对照酶pyre比酶活力的37％。在重组菌株e.coli cr05的基因组上基因umpg位点整合表达乳清酸磷酸核糖转移酶突变体基因pyre/k26h，构建获得重组菌株e.coli cr07。摇瓶水平发酵60h时，e.coli cr07的胞苷产量达469.3mg/l，相较于对照菌株e.coli cr06的胞苷产量显著提高(图2)。结果证明，基因组上乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyre的整合表达，提高了胞苷合成途径的代谢通量，进一步提高了胞苷的生产水平。
[0065]
实施例3：增强胞苷合成途径的代谢通量提高其积累水平
[0066]
为进一步提高胞苷合成途径的代谢通量，采用引物pyrh-fw和pyrh-rs，以大肠杆菌mg1655基因组为模板，进行pcr，获得基因片段，连接至t载体质粒pmd-18t，构建获得重组质粒pmd-18t-pyrh。以质粒pmd-18t-pyrh为模板，采用引物pyrh-r92g/d93g-fw和pyrh-r92g/d93g-rs进行全质粒pcr，获得含有突变位点r92g和d93g的突变体基因pyrh-r92g/d93g。在e.coli cr07基因组上的基因poxb位点整合表达基因pyrh(r92g/d93g)，并敲除(或沉默)丙酮酸氧化酶基因poxb，增强前体物质丙酮酸的积累，构建获得重组e.coli cr08。与e.coli cr07相比较，重组菌株e.coli cr08基因组上的丙酮酸氧化酶基因poxb敲除，且在基因组上整合表达了尿苷酸激酶突变体基因pyrh(r92g/d93g)，同时敲除(失活)丙酮酸氧化酶基因poxb增强前体物质丙酮酸的积累。具体实验步骤为：采用引物sg-poxb-fw和ptargetf-rs，以质粒ptargetf为模板，进行全质粒pcr构建质粒ptargetf-poxb。采用引物δpoxb::pyrh(r92g/d93g)-up-fw、δpoxb::pyrh(r92g/d93g)-up-rs、δpoxb::pyrh(r92g/d93g)-down-fw、δpoxb::pyrh(r92g/d93g)-down-rs，以e.coli mg1655基因组为模板获得整合框上下游同源臂pyrh(r92g/d93g)-g1和pyrh(r92g/d93g)-g2，采用引物δpoxb::pyrh(r92g/d93g)-mid-fw和δpoxb::pyrh(r92g/d93g)-mid-rs，以质粒petac-pyrh(r92g/d93g)为模板获得表达框pyrh(r92g/d93g)-z。采用引物δpoxb::pyrh(r92g/d93g)-up-fw和δpoxb::pyrh(r92g/d93g)-down-rs，以pyrh(r92g/d93g)-g1、pyrh(r92g/d93g)-g2、pyrh(r92g/d93g)-z为模板进行融合pcr，获得donor dna片段。将ptargetf-poxb和donor dna导入含有pcas质粒的重组菌株e.coli cr07的电转感受态中，筛选获得整合pyrh
rbs-gnd-rbs-prs更有利于重组菌株e.coli cr09胞苷的积累。
[0071]
实施例5：重组菌发酵生产胞苷
[0072]
30l发酵罐发酵培养基为：葡萄糖60g/l、mgso
4 2g/l、柠檬酸钠6mg/l、氯化钙230mg/l、磷酸氢二钠6g/l、磷酸二氢钠5g/l、氯化锌29mg/l、酵母粉7g/l、蛋白胨13g/l、氯化铜76mg/l、硫酸锌2mg/l、钼酸钠5mg/l。补料培养基：葡萄糖730g/l、蛋白胨11g/l、酵母粉15g/l。30l发酵罐的发酵条件为：将菌株接种至lb培养基中，37℃和200rpm，培养10h，将lb培养基中的种子液按照8％接种量，转接至发酵培养基中(30l发酵罐，初始装液量为12l)，在35℃和200rpm条件下进行发酵培养，通过测定发酵液中葡萄糖控制葡萄糖浓度为15
±
2g/l；控制溶氧为25％，当低于25％，提高搅拌转速、通气量和罐压。采用氨水控制ph为6.7。发酵结束后，离心除菌体，取上清液，采用hplc测定其中胞苷的含量。采用30l发酵罐进行高密度发酵时，发酵48h时，e.coli cr09可以高效生产胞苷，产量达到61.9g/l，且杂质尿嘧啶等的含量非常低(图4、图5)。
[0073]
对比例1：
[0074]
具体实施方式同实施例2，区别在于，在菌株e.coli cr08基因组上nrdd基因位点整合表达prs、zwf和gnd基因时，在基因prs与zwf中间不添加rbs序列(agga)；在基因zwf与gnd中间不添加rbs序列(agga)时，其串联示意图为zwf-gnd-prs(构建融合表达基因片段的方法包括：petac-z-gnd-fw、petac-z-gnd-rs、petac-gnd-prs-fw、petac-gnd-prs-rs、petac-gnd-prs-zwf-fw、petac-gnd-prs-zwf-rs、ptarget-rs)。构建获得的重组菌株e.coli cr09a摇瓶水平的胞苷产量仅为619.1mg/l。
[0075]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种重组大肠杆菌，敲除了基因组上的胞苷脱氨酶基因cdd、尿苷激酶基因udk、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihb、核苷酸5
’‑
单磷酸核苷酶基因ppnn、丙酮酸氧化酶基因poxb和核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdd，并整合表达5
’‑
ctp二磷酸水解酶和/或乳清酸磷酸核糖转移酶。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述5
’‑
ctp二磷酸水解酶具有seq id no.6所示的氨基酸序列；所述乳清酸磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如seq id no.8或seq id no.10所示。3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在umph位点整合5
’‑
ctp二磷酸水解酶和/或乳清酸磷酸核糖转移酶的编码基因。4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述5
’‑
ctp二磷酸水解酶的基因序列如seq id no.5所示；所述乳清酸磷酸核糖转移酶的基因序列如seq id no.7或seq id no.9所示。5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在丙酮酸氧化酶基因poxb所在位置整合表达尿苷酸激酶突变体；所述尿苷酸激酶突变体具有seq id no.14所示的氨基酸序列。6.根据权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌在核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdd所在位置整合表达磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因gnd。7.根据权利要求1～6任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌选自：dh5α、bl21(de3)、jm109、hb101或mg1655。8.一种发酵生产胞苷的方法，其特征在于，将权利要求1～7任一所述的重组大肠杆菌在含葡萄糖的培养基中发酵。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基含有：葡萄糖12-85g/l、mgso
4 0.5-5g/l、柠檬酸钠1.6-19mg/l、氯化钙7-560mg/l、磷酸氢二钠0.1-7.9g/l、磷酸二氢钠0.6-10.3g/l、氯化锌0.7-72mg/l、酵母粉0.3-11g/l、蛋白胨0.5-21g/l、氯化铜5-145mg/l、硫酸锌1-9.2mg/l、钼酸钠1.3-165mg/l。10.权利要求1～7任一所述的重组大肠杆菌在发酵生产胞苷方面的应用。

技术总结
本发明公开了增强胞苷生产的方法及应用，属于基因工程和微生物工程领域。本发明通过敲除胞苷脱氨酶基因cdd、尿苷激酶基因udk、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihB、核苷酸5


技术研发人员：张玮琪 张剑
受保护的技术使用者：江苏香地化学有限公司
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/8/9