一株酿酒酵母QLJJ72及其在啤酒酿造中的应用的制作方法

一株酿酒酵母qljj72及其在啤酒酿造中的应用
技术领域
1.本发明涉及一株酿酒酵母qljj72及其在啤酒酿造中的应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.在历史上，啤酒的酿造原料主要有四种，它们分别是大麦芽、水、啤酒花和酵母，随着酿酒工艺的发展和啤酒的广泛传播，酿酒师尝试把小麦芽作为啤酒的原料之一，并得到了具有良好口感和独特麦香的小麦啤酒。
3.由于小麦芽原料替代了部分大麦芽，小麦啤酒与纯大麦啤酒具有不同的营养成分，对酵母发酵过程也会产生不同的影响。通常为了更好地突出小麦啤酒的口感，获得更稳定、更具杀口感的小麦啤酒，需要采用专用的小麦啤酒酿酒酵母。
4.我国啤酒市场的消费需求可能不会大幅增长，预计未来啤酒行业将加速整合进程，行业竞争将更加激烈。在啤酒产量负增长的情况下，为提高利润，就需要降低啤酒的生产成本。而优化啤酒的酿造工艺或者筛选优良的酿酒酵母菌种，是降低生产成本的主要措施。
5.啤酒中的高级醇含量，对高端啤酒的品质影响较大。高级醇是指3个或3个以上碳原子的醇类的统称，主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇等。虽然一定量的高级醇能赋予啤酒独特的香味，高级醇含量过低的啤酒其酒体不丰满，口感欠佳。但总体上，啤酒高级醇含量过高是业内普遍存在的问题，制约了啤酒风味的提升并引发消费者产生“上头”的不良反应。将高级醇含量限制在较低的合理范围内对于提升啤酒品质具有积极的意义。
6.尤其是小麦啤酒中，由于原料本身营养更丰富，蛋白质含量更高，导致小麦啤酒中高级醇的含量比大麦啤酒高，可达到300mg/l左右，有时甚至会超过350mg/l。为提高小麦啤酒的饮用体验和品质，需要大幅度降低小麦啤酒中的高级醇含量。
7.中国专利文献cn 105018360 a(申请号201510416932.9)公开了一种酿酒酵母诱变菌株及其应用。该发明的酿酒酵母诱变菌株的保藏编号为cgmccno.10572，该酿酒酵母诱变菌株可以显著增强双乙酰的还原能力、提高挥发性酯类物质含量、降低高级醇含量，所述高级醇为异戊醇和/或正丙醇，通过实验证明，与出发菌株相比，该酿酒酵母诱变菌株可以降低正丙醇和异戊醇的含量，但是异丁醇含量不降反升。
8.中国专利文献cn 101914461 a(申请号201010227788.1)公开了一种低产高级醇酿酒酵母工程菌及其构建方法。该发明提供的酿酒酵母工程菌是通过向出发菌酿酒酵母2.1190中插入一个核苷酸序列或者通过缺失部分或完整氨基酸转氨酶编码基因(bat2)序列来实现的。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下，转化子菌株比亲本菌株的异丁醇、异戊醇含量分别降低了55.19％、34.43％，总高级醇含量降低35.01％，但是该菌株适用于白酒酿造，而非啤酒酿造，更非小麦啤酒酿造。


技术实现要素：

9.针对现有技术的不足，本发明提供了一株酿酒酵母qljj72及其在啤酒酿造中的应用。
10.本发明的技术方案如下：
11.一株酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)qljj72，于2022年9月26日保藏于广州省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no.62835。
12.上述酿酒酵母qljj72是由酿酒酵母bks-03经诱变筛选后得到的。
13.上述酿酒酵母qljj72的培养方法，包括如下步骤：取酿酒酵母qljj72接入麦汁培养基中，发酵培养。
14.根据本发明优选的，所述发酵培养的温度为16～28℃。
15.上述酿酒酵母qljj72在啤酒酿造中的应用。
16.根据本发明优选的，所述啤酒为小麦啤酒。
17.进一步优选的，所述小麦啤酒的麦芽原料包括大麦芽50-60份，小麦芽35-40份，黑麦芽0-5份，均为重量份。
18.上述酿酒酵母qljj72在降低酿造啤酒高级醇含量中的应用。
19.根据本发明优选的，所述高级醇包括异丁醇、异戊醇、正丙醇和苯乙醇。
20.根据本发明优选的，所述啤酒为小麦啤酒。
21.进一步优选的，所述小麦啤酒的麦芽原料包括大麦芽50-60份，小麦芽35-40份，黑麦芽0-5份，均为重量份。
22.一种产品，其活性成分为上述酿酒酵母qljj72。
23.根据本发明优选的，所述产品为按照上述培养方法发酵培养得到的发酵物。
24.上述产品在啤酒酿造中的应用。
25.根据本发明优选的，所述啤酒为小麦啤酒。
26.进一步优选的，所述小麦啤酒的麦芽原料包括大麦芽50-60份，小麦芽35-40份，黑麦芽0-5份，均为重量份。
27.上述产品在降低酿造啤酒高级醇含量中的应用。
28.根据本发明优选的，所述高级醇包括异丁醇、异戊醇、正丙醇和苯乙醇。
29.根据本发明优选的，所述啤酒为小麦啤酒。
30.进一步优选的，所述小麦啤酒的麦芽原料包括大麦芽50-60份，小麦芽35-40份，黑麦芽0-5份，均为重量份。
31.有益效果：
32.本发明筛选出了一株低产高级醇的酿酒酵母qljj72，可满足低高级醇含量小麦精酿啤酒的酿造需求，可以同时降低啤酒中苯乙醇、正丙醇、异丁醇和异戊醇的含量。使用酿酒酵母qljj72酿造啤酒，在发酵指标基本保持稳定且不增加生产成本的同时，保持了良好风味和口感，经风味测评并不会产生“上头”的感觉，能够满足酿造高品质小麦啤酒的技术需求。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中涉及的实验步骤，若无特殊说明，均为本领域常规技术操作。
34.实施例中涉及的微生物：
35.一株酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)qljj72，于2022年9月26日保藏于广州省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no.62835。
36.上述菌株由酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)bks-03经诱变筛选而得，酿酒酵母bks-03由啤酒厂提供。
37.实施例1：酿酒酵母的诱变筛选
38.1、诱变方法：
39.(1)紫外线诱变
40.将出发菌株酿酒酵母bks-03在琼脂固体ypd培养基上进行纯化，挑取纯化后的单菌落接种至液体ypd培养基中培养到对数生长期，在无菌环境下取对数生长期的菌液1.0ml，以10倍梯度稀释法制成10-1
～10-5
的酿酒酵母菌悬液，涂布在琼脂固体ypd培养基平板上，并在垂直于紫外灯(20w)的25～30cm处照射，照射时间分别为0s(对照)、10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s，照射完成后，立即用遮光纸包裹，在28℃生化培养箱中倒置培养72h，培养后根据菌落数计算致死率，以致死率85％～90％的照射时间为最佳诱变剂量。
41.其中，致死率的计算公式如下：
[0042][0043]
(2)artp诱变
[0044]
将出发菌株酿酒酵母bks-03在琼脂固体ypd培养基上进行纯化，挑取纯化后的单菌落接种至液体ypd培养基中培养到对数生长期，采用无菌生理盐水以10倍梯度稀释法将对数生长期的菌液制成od
600
为0.6～0.8之间的菌悬液。准确吸取10μl菌悬液均匀的涂布于无菌金属载片表面，即刻进行artp诱变处理。调节artp诱变处理的各项参数，使载片与放射源之间距离为2.5mm、仪器功率为100w、气流量参数为10slm，设置诱变处理时长梯度为0s(对照)、10s、20s、25s、30s、35s、40s、45s。诱变完成后，将载片转移至装有1ml生理盐水的1.5ml离心管，短暂振荡混匀得菌悬液。取适量菌悬液涂布于琼脂固体ypd培养基平板上，30℃倒置培养48h。观察菌株生长情况，计算菌落数与致死率。致死率计算方法同上。以致死率85％～90％的诱变处理时长为最佳诱变剂量。
[0045]
2、菌种筛选
[0046]
(1)初筛
[0047]
按照上述最佳诱变剂量进行诱变，将诱变后的菌种在琼脂固体ypd培养基上进行培养，28℃培养72h，挑取边缘整齐、表面光滑、微黄色、圆润凸起的菌落，逐级扩培，进行小麦啤酒小试发酵试验后，测定小试小麦啤酒中高级醇的含量，选择高级醇产量较低的菌株，再进行下一步复筛。
[0048]
(2)复筛
[0049]
将初筛的菌株扩培制作种子液，进行小麦啤酒中试发酵试验。以出发菌株酿酒酵母bks-03为对照，测定初筛菌株发酵的中试小麦啤酒高级醇含量及其他发酵指标，选取高级醇含量低、双乙酰含量低、发酵性能优良的菌株确定为优良菌种。
[0050]
3、小麦啤酒发酵
[0051]
(1)小麦啤酒小试发酵试验
[0052]
称取1.5g扩培后的酿酒酵母(湿重)接入装有300ml麦汁的500ml锥形瓶中，安装发酵栓并加水密封，于20℃发酵10天，每天两次轻轻晃动锥形瓶，并每隔24h测co2失重，当co2失重小于0.1g/d时，认为主发酵结束。主发酵结束后检测麦汁的发酵度及发酵液的双乙酰含量。
[0053]
(2)小麦啤酒中试发酵试验
[0054]
将初筛的菌株进行三角瓶菌种扩培，扩培方法为：取初筛的斜面菌株一环接入9ml麦汁试管中，于25℃培养48h，用移液器取3ml菌液打入含20ml麦汁的小锥形瓶中，于25℃培养48h，后全部转入200ml麦汁中，于22℃继续培养36h，再将菌液全部转入1500ml麦汁中，16℃培养24h，得种子液。
[0055]
在50l发酵罐中装11
°
p麦汁30l，接入逐级扩培的种子液1500ml(接种量为5％)，在20℃下发酵8天，然后降温至4℃，保持24小时，继续降温至0℃，保持6天，发酵结束。发酵结束后检测双乙酰、酒精度和发酵度等发酵指标数据。
[0056]
(3)啤酒麦汁制备方法
[0057]
大麦芽60份，小麦芽35份，黑麦芽5份，均为重量份，以1:4料水质量比加入净化水，45℃保温15分钟，升温至68℃保温35分钟，升温至72℃保温18分钟，升温至78℃过滤。将过滤液煮沸50分钟，打料入回旋沉淀槽，沉淀30分钟。将经回旋沉淀的料液冷却，即得到啤酒麦汁。麦汁浓度为11
°
p。
[0058]
4、检测方法
[0059]
(1)高级醇的检测方法
[0060]
高级醇的检测采用气相色谱法，在“王雅楠,王倩,刘延琳,宋育阳,秦义.葡萄酒高级醇检测方法的优化及其在本土酿酒酵母筛选中的应用[j].中国酿造,2020,39(06):47-52.”所述方法基础上略有改动。
[0061]
安捷伦8860气相色谱仪，fid检测器，毛细管色谱柱hp-inno-wax(50m
×
320μm
×
1.0μm)，载气为纯度为99.99％的高纯氮气，分流比1:10。进样口温度210℃，检测器温度210℃，进样量1μl。程序升温，50℃保持8min，5℃/min升温，升温至180℃，保持15min。每个样品处理时间45min。
[0062]
(2)其他啤酒指标
[0063]
双乙酰、酒精度、发酵度等指标参照gb/t 4928-2008“啤酒分析方法”中方法进行检测。
[0064]
5、菌种鉴定
[0065]
挑取最终筛选到的菌株接种至装有50ml液体ypd培养基的500ml摇瓶中，28℃，150rpm培养24h。取5ml培养液8000g离心2min，弃上清，采用酵母dna提取试剂盒提取菌体基因组dna，用酵母its序列通用引物its1和its4，扩增基因组dna，pcr产物用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序。
[0066]
将测序得到的its序列与genbank数据库中酵母菌的序列进行比对，菌株鉴定为酿酒酵母菌株，并重新命名为酿酒酵母qljj72。
[0067]
酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)qljj72，于2022年9月26日保藏于广州省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no.62835。
[0068]
实施例2
[0069]
采用实施例1中记载的小麦啤酒中试发酵试验方法，将出发原始菌株酿酒酵母bks-03和突变菌株酿酒酵母qljj72进行小麦啤酒中试发酵，各做三批。
[0070]
其中，小麦啤酒中试发酵使用的麦芽原料组成包括两组：
[0071]
第一组：大麦芽60份，小麦芽35份，黑麦芽5份，均为重量份；
[0072]
第二组：大麦芽60份，小麦芽40份，均为重量份。
[0073]
啤酒麦汁的制备方法与实施例1记载的相同。制备得到的麦汁浓度均为11
°
p。
[0074]
发酵结束后检测小麦啤酒双乙酰、酒精度和发酵度三项发酵指标数据，结果如表1所示。
[0075]
表1.酿酒酵母bks-03和酿酒酵母qljj72酿造的小麦啤酒发酵指标
[0076][0077]
由表1可知，啤酒的发酵指标保持了基本稳定，在酒精度、发酵度及双乙酰含量的关键指标上，突变菌株酿酒酵母qljj72与出发原始菌株酿酒酵母bks-03发酵得到的啤酒基本保持一致，没有明显变化。
[0078]
取上述发酵得到的啤酒，按照实施例1记载的检测方法，比较出发原始菌株酿酒酵母bks-03和突变菌株酿酒酵母qljj72酿造啤酒中高级醇的含量。结果如表2所示。
[0079]
表2.酿酒酵母bks-03和酿酒酵母qljj72酿造啤酒的高级醇含量
[0080][0081]
由表2可知，本发明的酿酒酵母qljj72发酵得到啤酒中高级醇含量比出发原始菌株酿酒酵母bks-03明显下降，其中，第一组小麦啤酒中苯乙醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇分别下降21.24％、18.70％、15.29％、26.73％，第二组小麦啤酒中苯乙醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇分别下降34.26％、29.23％、18.28％、31.92％。在两组不同原料配方的小麦啤酒中，酿酒酵母qljj72发酵的小麦啤酒中高级醇总和数值分别降低25.73％和27.89％。
[0082]
通过多次传代实验，表明本发明的酿酒酵母qljj72发酵产啤酒的高级醇含量、酒精度、发酵度等关键发酵性能指标保持稳定，在十代时仍然保持了优良性能，证明酿酒酵母qljj72不仅性能优异，同时遗传稳定性良好，适合用于优质啤酒的生产。
[0083]
对比例1
[0084]
将出发原始菌株酿酒酵母bks-03和突变菌株酿酒酵母qljj72进行大麦啤酒中试发酵，各做三批。
[0085]
其中，啤酒麦汁的制备方法如下：
[0086]
大麦芽95份，黑麦芽5份，均为重量份，以1∶4料水质量比加入净化水，35℃保温10分钟，升温至50℃保温20分钟，升温至65℃保温40分钟，升温至72℃保温20分钟，升温至78℃保温5分钟后过滤。将过滤液煮沸70分钟，打料入回旋沉淀槽，沉淀20分钟。将经回旋沉淀的料液冷却，即得到啤酒麦汁。麦汁浓度为11
°
p。
[0087]
采用上述啤酒麦汁进行大麦啤酒中试发酵试验，试验步骤与实施例1中记载的小麦啤酒中试发酵试验步骤相同。
[0088]
发酵结束后检测大麦啤酒双乙酰、酒精度和发酵度三项发酵指标数据，结果如表3所示。
[0089]
表3.酿酒酵母bks-03和酿酒酵母qljj72酿造的大麦啤酒发酵指标
[0090]
菌株酒精度(％)发酵度(％)双乙酰(mg/l)bks-033.7067.780.120qljj723.7567.940.117
[0091]
由表3可知，酿酒酵母qljj72用于大麦啤酒发酵时的主要发酵指标与酿酒酵母bks-03高度相似，没有表现出明显变化。
[0092]
取上述发酵得到的啤酒，按照实施例1记载的检测方法，比较出发原始菌株酿酒酵母bks-03和突变菌株酿酒酵母qljj72酿造大麦啤酒中高级醇的含量。结果如表4所示。
[0093]
表4.酿酒酵母bks-03和酿酒酵母qljj72酿造大麦啤酒的高级醇含量
[0094]
菌株苯乙醇(mg/l)正丙醇(mg/l)异丁醇(mg/l)异戊醇(mg/l)总和(mg/l)bks-036.022.339.7144.8062.86qljj725.022.258.1740.9255.36
[0095]
由表4可知，本发明的酿酒酵母qljj72发酵得到啤酒中高级醇含量与出发原始菌株酿酒酵母bks-03相比，下降不明显，苯乙醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇分别下降16.61％、3.43％、15.86％、8.66％，酿酒酵母qljj72用于大麦啤酒的发酵时，其产生的高级醇总和相比出发菌bks-03亦有一定程度的下降，降幅为11.93％。
[0096]
由以上实验可知，本发明的酿酒酵母qljj72可以显著降低啤酒中异丁醇、异戊醇、正丙醇和苯乙醇的含量，但在制备小麦啤酒时，其表现出的降低高级醇含量能力更加明显，因而该酵母菌可用于制备低高级醇含量的小麦精酿啤酒专用酵母。

技术特征：
1.一株酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)qljj72，其特征在于，于2022年9月26日保藏于广州省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no.62835。2.一种产品，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述的酿酒酵母qljj72。3.如权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为权利要求1所述的酿酒酵母qljj72经发酵培养得到的发酵物，所述发酵培养是取酿酒酵母qljj72接入麦汁培养基中，16～28℃发酵培养。4.权利要求1所述的酿酒酵母qljj72或者权利要求2所述的产品的应用，其特征在于，应用于啤酒酿造。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述啤酒为小麦啤酒。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述小麦啤酒的麦芽原料包括大麦芽50-60份，小麦芽35-40份，黑麦芽0-5份，均为重量份。7.权利要求1所述的酿酒酵母qljj72或者权利要求2所述的产品的应用，其特征在于，应用于降低酿造啤酒的高级醇含量。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述高级醇包括异丁醇、异戊醇、正丙醇和苯乙醇。9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述啤酒为小麦啤酒。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述小麦啤酒的麦芽原料包括大麦芽50-60份，小麦芽35-40份，黑麦芽0-5份，均为重量份。

技术总结
本发明涉及一株酿酒酵母QLJJ72及其在啤酒酿造中的应用，属于生物工程技术领域。本发明筛选出了一株低产高级醇的酿酒酵母QLJJ72，可满足低高级醇含量小麦精酿啤酒的酿造需求，可以同时降低啤酒中苯乙醇、正丙醇、异丁醇和异戊醇的含量。使用酿酒酵母QLJJ72酿造啤酒，在发酵指标基本保持稳定且不增加生产成本的同时，保持了良好风味和口感，经风味测评并不会产生“上头”的感觉，能够满足酿造高品质小麦啤酒的技术需求。啤酒的技术需求。


技术研发人员：朱德强 段敏 刘新利 崔田生
受保护的技术使用者：山东巴克斯啤酒有限公司 酵爵健康科技（重庆）有限公司
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/13