一种葡萄糖脱氢酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体及其应用。


背景技术：

2.葡萄糖脱氢酶gdh2是一类可以将葡萄糖催化成葡萄糖酸钙，同时还可以将nad+或nad(p+)为电子受体生成nad(p)h的酶。nad(p)h再生的许多氧化还原反应中，在工业生物催化制药前体的合成方面具有巨大的应用潜力。在工业生物催化制药过程中，对这些催化酶的稳定性和活性都有一定的要求，热稳定性好且活性高的生物催化酶，可以大大地降低生物催化制药的成本，提高催化效率。为了寻找热稳定性高的生物酶，一些耐热细菌为优选宿主，古菌以及一些嗜热菌因具有耐热性，其来源的生物酶通常也具有很好的耐热性和活性。硫磺矿硫化叶菌属于古菌，在进化上与嗜酸热硫化叶菌相近，因此具有潜在的耐热性。硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus zillig et al.)来源的gdh2，从其序列同源性上来看，属于葡萄糖脱氢酶，但是目前关于该酶的信息还不清楚。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种高表达的葡萄糖脱氢酶突变体和应用。
4.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
5.本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体，所述葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述葡萄糖脱氢酶突变体。
7.进一步改进在于，所述多核苷酸的序列如seq id no.2所示。
8.本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒为含有上述多核苷酸且能够翻译表达出上述葡萄糖脱氢酶突变体的表达载体。
9.进一步改进在于，所述表达载体为pet-28a。
10.本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体表达系统，为转入上述重组质粒的大肠杆菌bl21。
11.本发明提供了一种上述葡萄糖脱氢酶突变体作为催化酶在工业生物催化制药过程中辅酶nadh及nadph再生中的应用。
12.本发明提供了一种辅酶因子nad(p)h的获得方法，以nad(p+)为底物，利用上述葡萄糖脱氢酶突变体将nad(p+)转化成nad(p)h。
13.本发明具有如下有益效果：
14.本发明提供了一种以葡萄糖为底物的来源于硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus zillig et al.)的葡萄糖脱氢酶突变体，该突变体通过将葡萄糖脱氢酶蛋白序列的第52位的精氨酸突变为天冬氨酸，第114位的甘氨酸突变为丙氨酸，第228位的脯氨酸突变为丙氨酸，第241位的丝氨酸突变为谷氨酰胺，使其与野生型的葡萄糖脱氢酶相比
具有更高的热稳定性，野生型tm值为63.74℃、突变体tm值为79.3℃，较野生型增加了15℃，具有与嗜热菌相似的tm值，为该酶在工业生物催化制药过程中的应用提供了良好的应用场景。
15.此外，本发明提供的葡萄糖脱氢酶突变体还具有氧化还原反应中辅酶nadh以及nadph的再生中的应用，野生型的gdh2未检测到明显的nadh和nadph再生的活性，其突变体gdh2-4m还原nadp+活性比野生型高6.5倍，还原nad+活性比野生型高3.5倍。其突变体更适合nadh和nadph再生中的应用，为工业生物催化制药过程nadh和nadph的再生提供了更好的催化酶。
附图说明
16.图1为野生型gdh2及其突变体蛋白小量表达sds-page检测结果；
17.图2为野生型gdh2及其突变体蛋白亲和纯化结果；
18.图3为野生型gdh2及其突变体蛋白热稳定性检测结果；
19.图4为野生型gdh2及其突变体蛋白再生nad(p)h活性曲线；
20.图5为野生型gdh2及其突变体蛋白再生nad(p)h活性参数。
具体实施方式
21.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
22.1、材料
23.本发明所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
24.2、方法
25.2.1重组质粒的构建及表达
26.(1)野生型gdh2(氨基酸蛋白序列见seq id no.3)及gdh2突变体gdh2-4m、gdh2-6m(氨基酸蛋白序列见seq id no.4)的基因序列均是通过基因合成获得，表达载体为pet-28a，重组质粒均经测序验证与目标序列完全一致，gdh2突变体gdh2-4m是在野生型gdh2的原始序列基础上将52位的精氨酸突变为天冬氨酸，第114位的甘氨酸突变为丙氨酸，第228位的脯氨酸突变为丙氨酸，第241位的丝氨酸突变为谷氨酰胺，gdh2-4m的氨基酸序列如seq id no.1所示，其编码基因如seq id no.2所示。gdh2突变体gdh2-6m是在野生型gdh2的原始序列基础上将第52位的精氨酸突变成亮氨酸，第114位的甘氨酸突变成丙氨酸，第119位苏氨酸突变成异亮氨酸，第194位苏氨酸突变成异亮氨酸，第228位的脯氨酸突变成丙氨酸，第313脯氨酸突变为酪氨酸，gdh2-6m的氨基酸序列如seq id no.4所示。
27.将野生型gdh2和gdh2突变体(gdh2-4m和gdh2-6m)两种类型的重组质粒分别按照常规分子生物学手段分别转化bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌斑至5ml lb液体培养基中，37℃培养，待菌液od600至0.6-0.8时取少量菌液用loading buffer进行固定，并取少量菌液加入甘油冻至-80℃，剩余菌液加入0.5mm iptg诱导4个小时后，收集菌体
并取诱导后菌液进行sds-page检测。根据sds-page结果可知，野生型gdh2和gdh2突变体(gdh2-4m和gdh2-6m)在bl21(de3)大肠杆菌中均明显表达(图1)。
28.(2)诱导表达融合蛋白：将上述明显表达的菌株分别接种至50ml lb液体培养基中37℃培养过夜，将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1l lb液体培养基中，37℃培养至菌液od600为0.6-0.8时加入0.5mm iptg 15℃培养过夜，5000rpm离心收集菌体。
29.(3)蛋白纯化：将上述收集的菌体进行称重，再分别按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mm tris-hcl(ph8.0)，500mm nacl，5％甘油)，使用高压均质机破碎菌体，16000rpm高速离心收集上清。再使用亲和层析柱his ff富集纯化蛋白，纯化前先用裂解buffer平衡his ff柱，将所有细胞上清挂柱后，用不同梯度的咪唑溶液洗脱，收集不同梯度咪唑洗脱下的蛋白进行sds-page检测，根据sds-page结果可知，通过亲和纯化获得了纯度较高的野生型gdh2蛋白和gdh2突变体蛋白。结果见图2。
30.2.2野生型gdh2和gdh2突变体重组蛋白的热稳定性检测
31.野生型gdh2和gdh2突变体重组蛋白gdh2-4m和gdh2-6m热稳定性的检测技术选用蛋白质热熔解技术(protein thermal shift，thermofluor)。该技术通过检测疏水性结合染料(如orange)的变化来进行蛋白质稳定性的研究，orange对蛋白的疏水部分有亲和性。在有水或亲水环境中与蛋白处于未结合状态，荧光较弱；当温度上升，蛋白变性暴露出疏水区时，orange与蛋白结合并被激发荧光。具体的实验方法如下：
32.(1)分别取5μl浓度为1mg/ml的野生型gdh2、gdh2-4m和gdh2-6m，与5μl染料浓度为20x的orange染料混匀后，加到384孔实验板中，震荡离心后(避免样品不均匀或吸样过程中吸进气泡)，将实验板放入qpcr仪器中检测，设置初始温度为20℃，以每分钟升温2.0℃的速度最终上升到99℃终止。仪器会依照设置好的参数进行升温和实时检测，tm值测试的结果见图3。
33.(2)结果分析：野生型gdh2的tm值为63.74℃，gdh2-4m的tm值为79.3℃。gdh2-6m的tm值为76.8℃。说明当野生型gdh2蛋白序列的第52位的精氨酸(r)突变成天冬氨酸(d)，第114位的甘氨酸(g)突变成丙氨酸(a)，第228位的脯氨酸(p)突变成丙氨酸(a)，第241位的丝氨酸(s)突变成谷氨酰胺(q)，tm值增加了15℃，具有与嗜热菌相似的tm值。当野生型gdh2蛋白序列的第52位的精氨酸(r)突变成亮氨酸(l)，第114位的甘氨酸(g)突变成丙氨酸(a)，第119位苏氨酸(t)突变成异亮氨酸(i)，第194位苏氨酸(t)突变成异亮氨酸(i)，第228位的脯氨酸(p)突变成丙氨酸(a)，第313脯氨酸(p)突变为酪氨酸(y)，tm值增加了13℃蛋白的热稳定性大大提高，已知在工业生物催化制药过程中，存在一些酶因为在高温下不稳定而限制了其应用，通过定向进化筛选出具有热稳定性的突变株已经成为一种常规的生物学手段，而本发明通过对野生型gdh2蛋白序列的第52位、第114位、第119位、第194位、第228位和第241位氨基酸进行突变，大大提高了蛋白的热稳定性，也为gdh2在工业生物催化制药中的应用提供了更好的应用场景。
34.2.3gdh2突变体重组蛋白活性检测
35.gdh2作为一种葡萄糖脱氢酶，可以以葡萄糖为底物，将nad(p)+转化为nad(p)h。本发明提供的测活体系以葡萄糖和nad(p+)作为底物，因nad(p+)为无色，而nad(p)h在340nm处有荧光吸收，当反应体系中将nad(p+)转换成而nad(p)h后，就可以在340nm处检测荧光信号。本发明以每纳摩尔gdh2每秒产生的荧光信号强度表示酶活参数。将gdh2、gdh2-4m和
gdh2-6m 3种蛋白的活性进行对比。具体的实验操作如下：
36.(1)准备缓冲液：50mm tris ph8.0、底物为5mm glucose和2mm nadp+以及2mm nad+，反应温度为20℃。用缓冲液分别将gdh2、gdh2-4m和gdh2-6m从1μm以2倍梯度稀释，共稀释12个浓度。将30μl底物转移至384孔板中并设置两个复孔，转移30μl待测gdh2、gdh2-4m和gdh2-6m至相应的孔板中，立即离心并振荡混匀，使用tecan f200酶标仪收集反应产生的荧光信号值。运用graphpad prism9分析软件进行数据分析，最终获得待测蛋白酶的酶活参数，结果如图4和图5所示。
37.(2)结果分析：野生型gdh2的nad酶活参数为2.7
×
10-7
、gdh2-4m和gdh2-6m蛋白的nad酶活参数分别为9.4
×
10-7
和1.6
×
10-7
，野生型gdh2的nadp酶活参数为3.8
×
10-7
，gdh2-4m和gdh2-6m蛋白的nadp酶活参数为2.5
×
10-6
和4.3
×
10-7
(图5)。根据酶活数据可知：野生型gdh2基本无nad和nadp酶活性，其突变体gdh2-6m也基本无nad和nadp酶活性，突变体gdh2-4m有明显的nad和nadp酶活(图4)，其中nad活性比野生型gdh2高出3.4倍，nadp活性比野生型gdh2高出6.5倍。本发明提供的gdh2突变体与野生型相比具有很高的将nad(p+)转化成nad(p)h的活性，在氧化还原反应中辅酶nadph的再生中的应用具有更高的价值。
38.2.4结论
39.本发明提供了一种以葡萄糖为底物的来源于硫磺矿硫化叶菌的gdh2突变体，该突变体与野生型gdh2相比具有更高的热稳定性，野生型gdh2的tm值为63.74℃、突变体的tm值为79.3℃，较野生型增加了15℃。本发明提供的突变体还具有氧化还原反应中辅酶nadh以及nadph的再生中的应用，其还原nad+活性比野生型高出3.5倍，其nad(p+)活性野生型高6.5倍，更适合nad(p)h再生中的应用，为工业生物催化制药过程nad(p)h的再生提供了更好的催化酶。
40.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体。3.根据权利要求2所述的一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如seq id no.2所示。4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为含有如权利要求2-3任一所述的多核苷酸且能够翻译表达出如权利要求1所述葡萄糖脱氢酶突变体的表达载体。5.根据权利要求4所述的一种重组质粒，其特征在于，所述表达载体为pet-28a。6.一种葡萄糖脱氢酶突变体表达系统，其特征在于，为转入权利要求4-5任一所述重组质粒的大肠杆菌bl21。7.一种权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体作为催化酶在工业生物催化制药过程中辅酶nadh及nadph再生中的应用。8.一种辅酶因子nad(p)h的获得方法，其特征在于，以nad(p+)为底物，利用权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体将nad(p+)转化成nad(p)h。

技术总结
本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶突变体及其应用，涉及蛋白质工程技术领域，所述葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的葡萄糖脱氢酶突变体通过将葡萄糖脱氢酶蛋白序列的第52位的精氨酸突变成天冬氨酸，第114位的甘氨酸突变成丙氨酸，第228位的脯氨酸突变成丙氨酸，第241位的丝氨酸突变成谷氨酰胺，使其与野生型的葡萄糖脱氢酶相比具有更高的热稳定性，野生型Tm值为63.74℃、突变体Tm值为79.3℃，较野生型增加了15℃，且突变体的辅酶也从无到有，其中NADP活性比野生型高出近6.5倍，NAD活性也比野生型高出3.4倍，为该酶在工业生物催化制药过程中的应用提供了良好的应用场景。供了良好的应用场景。供了良好的应用场景。


技术研发人员：王峰 陈倩 桂文君 王俊超 邵志鹏
受保护的技术使用者：无锡佰翱得生物科学股份有限公司
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/13