尼帕病毒的中和性人源单克隆抗体及应用

33位，51-58位，97-117位分别含有如seq id no:1-3所示的氨基酸序列，而42-27具有相同的重链，而轻链不同，轻链可变区具有lcdr1、lcdr2和lcdr3这三个互补决定区cdr。
8.niv42的轻链包含seq id no.8所示的氨基酸序列，其lcdr1包含如seq id no.5所示的氨基酸序列，lcdr2包含如seq id no.6所示的氨基酸序列，lcdr3包含如seq id no.7所示的氨基酸序列。
9.42-27的轻链包含seq id no.12所示的氨基酸序列，其lcdr1包含如seq id no.9所示的氨基酸序列，lcdr2包含如seq id no.10所示的氨基酸序列，lcdr3包含如seq id no.11所示的氨基酸序列。
10.本发明还公开了一种抗原结合片段，包含前述的尼帕病毒的中和性人源抗体重链可变区，以及一种双特异性抗体，包含前述的尼帕病毒的中和性人源抗体重链可变区，或前述的尼帕病毒抗体。
11.本发明还揭示了上述尼帕病毒的抗体重链可变区、尼帕病毒抗体和抗原结合片段在制备针对尼帕病毒的预防和治疗药物、检测探针、融合多肽、融合蛋白、免疫偶联物、遗传工程化的宿主细胞中的应用。
12.本发明提供的上述尼帕病毒的中和性人源单克隆抗体，是通过以下方法得到：首先构建人源fab噬菌体展示文库，然后以哺乳动物细胞表达体系表达的尼帕病毒囊膜蛋白胞外域为抗原，经过4轮筛选，得到一个富集、且具有高亲和力的克隆niv42。表达纯化该克隆，并进行鉴定与评价，对其生物学特应性、细胞水平上假病毒中和活性进行了鉴定与评价，表明该抗体能够有效中和尼帕病毒。同时，通过轻链替换方式，构建了亲和力成熟文库，并再次以尼帕病毒囊膜蛋白胞外域为抗原，经过筛选，得到一个富集、且具有高亲和力的克隆42-27。基于alpha fold2进行抗原抗体复合物结构预测发现，这一系列抗体主要通过重链发挥作用(如图6所示)，重链cdr3作用在抗原蛋白中央凹穴处，竞争结合囊膜蛋白g蛋白与受体结合位点，从而抑制病毒感染。
13.本发明的有益效果为：所提供的抗体能够特异性且高亲和力的结合尼帕病毒囊膜蛋白，对以vsv为骨架的尼帕假病毒具有有效的中和活性，在细胞水平上可有效中和尼帕病毒。其针对的表位不同于已报道的中和表位。因此，该系列抗体有希望成为新的特异的预防与治疗尼帕病毒的抗体药物，为尼帕病毒的防控提供更多选择。
附图说明
14.图1：尼帕病毒囊膜蛋白g蛋白表达纯化。目的蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测，泳道m为分子量标准，泳道g-fc为目的蛋白。
15.图2：niv42 igg和42-27igg抗体纯化后经sds-page检测。泳道niv42、42-27为目的蛋白。
16.图3：elisa测定的niv42 igg与42-27igg和尼帕病毒囊膜蛋白的结合。niv42 igg与抗原蛋白的结合浓度ec50为0.05μg/ml，42-27igg与抗原蛋白的结合浓度ec50为0.07μg/ml。
17.图4：niv42 igg与42-27igg中和尼帕假病毒实验。niv42 igg中和尼帕假病毒的中和活性ic50为0.007μg/ml，42-27igg中和尼帕假病毒的中和活性ic50为0.0007μg/ml。
18.图5：niv42 igg与42-27igg中和尼帕活病毒实验。niv42 igg中和尼帕活病毒的中
和活性ic50为0.177μg/ml，42-27igg中和尼帕活病毒的中和活性ic50为0.016μg/ml。
19.图6：42-27与抗原蛋白niv-g相互作用。通过alpha fold2预测软件进行抗原抗体复合物结构预测，抗体42-27主要通过重链的cdr3参与到与抗原的相互作用中。
具体实施方式
20.下面结合实施例和附图对本发明作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
21.实施例1：表达并纯化尼帕病毒囊膜蛋白
22.根据尼帕病毒的基因序列(genbank nc_002728.1)，将其囊膜蛋白的胞外域(氨基酸188-602)与igg1型的fc基因序列进行拼接，将拼接基因与载体psectag2a连接、转化，构建载体psectag2a-g-fc。转染前1天将293f细胞(控制细胞密度为5～
×
105个/ml)40ml接种于125ml悬浮细胞培养瓶。将40μg质粒(psectag2a-g-fc)稀释于4ml dpbs缓冲溶液中轻轻浑匀，再将120μl pei(polyethyleneimine)稀释于培养液中，轻轻浑匀。室温孵育20分钟后将它们逐滴加入细胞中。将细胞放入悬浮培养箱中，125转/分钟，37℃悬浮培养。
23.144小时后收集培养基上清，用anti-fc作为一抗通过蛋白免疫印迹(western blot)检测抗原蛋白的表达。
24.在检测到g-fc表达后，扩大细胞培养与转染规模，大量表达g-fc蛋白。收集培养基上清，用protein a填料纯化目的蛋白，随后用截留分子量为10kda的超滤离心管超滤置换缓冲液，经sds-page验证其纯度，结果见图1。
25.实施例2：噬菌体展示库的构建及筛选
26.利用已构建的噬菌体库，以哺乳动物细胞表达的抗原进行了筛选。将纯化后的抗原在96孔板中4℃孵育过夜时后，用噬菌体库中进行淘选，特异性的噬菌体被抗原所捕获，用pbs+0.05％ tween-20清洗，经过4轮筛选，得到富集克隆，命名为niv42。
27.对来源于健康且非免疫的捐赠者rna，通过pcr获取并大量扩增编码抗体轻链片段的基因，在亲本克隆niv42的抗体基因基础上，通过酶切连接方式，获得新的轻链改组的亲和力成熟文库，并再次以g-fc蛋白进行筛选，得到富集克隆，命名为42-27。
28.实施例3：niv42 igg与42-27igg的表达纯化
29.将niv42 fab与42-27fab的重链和轻链构建到igg1表达载体pivotro2-neo-mcs(市售)，用pei转染293f细胞进行表达，表达上清用protein a填料进行纯化，随后用截留分子量为30kda的超滤离心管超滤置换缓冲液，经sds-page验证其纯度，结果见图2。
30.实施例4：elisa测定niv42 igg与42-27igg和囊膜蛋白的结合
31.将囊膜蛋白(4μg/ml)包被在elisa板上，4℃孵育过夜后用pbs+3％milk于37℃封闭1h。加入系列稀释的抗体，37℃孵育2小时后用pbst(pbs+0.05％tween 20)洗四次，再加辣根过氧化物酶(hrp)标记的鼠抗人fc单克隆抗体于37℃孵育1小时后，用pbst洗四次，再加入abts进行检测。各个抗体的结合亲和力通过数据分析软件prism拟合计算得出。结果见图3。
32.实施例5：在vero细胞中niv42 igg与42-27igg抗体中和尼帕假病毒。
33.将100μl的vero(1
×
105个/ml)细胞接种96孔板，培养14～16h。按照抗体起始终浓
度为100μg/ml，三倍梯度稀释，将等体积的尼帕病毒假病毒与抗体稀释液进行混合，37℃孵育1小时。弃96孔板中的细胞培养基，用病毒和抗体混合液感染细胞，37℃静置培养24小时。第二天在荧光显微镜下观察细胞的荧光情况。通过高内涵扫描，分析每个孔板的荧光强度，荧光越弱，说明被假病毒感染的细胞越少，即被抗体中和的假病毒越多。各个抗体的半数抑制活性(ic50)通过数据分析软件prism计算得出。结果见图4。
34.实施例6：抗体niv42 igg与42-27igg中和尼帕活病毒。
35.将0.5ml的vero(1
×
105个/ml)细胞接种24孔板，培养14～16h。按照抗体起始终浓度为100μg/ml，三倍梯度稀释，将等体积的尼帕活病毒与抗体稀释液进行混合，37℃孵育1小时。弃24孔板中的细胞培养基，用病毒和抗体混合液感染细胞，37℃静置培养1小时。弃掉细胞孔板中的病毒-抗体混合液，加入含有羧甲基纤维素的培养基，在37℃静置培养4～5天。将细胞孔板进行灭活处理后，通过结晶紫染色，观察并统计噬斑的形成和数量。噬斑越少，说明被病毒感染的细胞越少，即被抗体中和的假病毒越多。各个抗体的半数抑制活性(ic50)通过数据分析软件prism计算得出。结果见图5。
36.实施例7：抗体41-6与抗原的相互作用界面预测
37.将抗体fab片段的序列与抗原序列写入文本中，通过alpha fold2数据库对抗原抗体复合物的结构进行多聚体形式的预测，对预测生成的结构，选择得分排名最高的结构进行分析。在软件pdbepisa对复合物的相互作用界面进行分析。结果见图6。
38.本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

技术特征：
1.一种尼帕病毒的中和性人源抗体重链可变区，其特征在于：所述重链可变区具有hcdr1、hcdr2和hcdr3这三个互补决定区cdr，所述hcdr1包含如seq id no.1所示的氨基酸序列；所述hcdr2包含如seq id no.2所示的氨基酸序列；所述hcdr3包含如seq id no.3所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述尼帕病毒的中和性人源抗体重链可变区，其特征在于：所述重链可变区包含如seq id no.4所示的氨基酸序列。3.一种尼帕病毒抗体，包含权利要求1或2所述尼帕病毒的中和性人源抗体重链可变区。4.根据权利要求3所述的尼帕病毒抗体，具有轻链，其特征在于：所述轻链的可变区具有lcdr1、lcdr2和lcdr3这三个互补决定区cdr，选自：所述lcdr1包含如seq id no.5所示的氨基酸序列；所述lcdr2包含如seq id no.6所示的氨基酸序列；所述lcdr3包含如seq id no.7所示的氨基酸序列；或所述lcdr1包含如seq id no.9所示的氨基酸序列；所述lcdr2包含如seq id no.10所示的氨基酸序列；所述lcdr3包含如seq id no.11所示的氨基酸序列。5.根据权利要求4所述的尼帕病毒抗体，其特征在于：所述轻链包含选自seq id no.8或seq id no.12所示的氨基酸序列。6.一种抗原结合片段，包含权利要求1或2所述尼帕病毒的中和性人源抗体重链可变区。7.一种双特异性抗体，包含权利要求1或2所述尼帕病毒的中和性人源抗体重链可变区，或权利要求3-5中任一项所述尼帕病毒抗体。8.权利要求1或2所述尼帕病毒的中和性人源抗体重链可变区在制备针对尼帕病毒的预防和治疗药物、检测探针、融合多肽、融合蛋白、免疫偶联物、遗传工程化的宿主细胞中的应用。9.权利要求3或4或5所述的尼帕病毒抗体在制备针对尼帕病毒的预防和治疗药物、检测探针、融合多肽、融合蛋白、免疫偶联物、遗传工程化的宿主细胞中的应用。10.权利要求6所述的抗原结合片段在制备针对尼帕病毒的预防和治疗药物、检测探针、融合多肽、融合蛋白、免疫偶联物、遗传工程化的宿主细胞中的应用。

技术总结
本发明公开了一种尼帕病毒的中和性人源单克隆抗体及应用，本发明所提供的抗体能够特异性且高亲和力的结合尼帕病毒囊膜蛋白，对以VSV为骨架的尼帕假病毒具有有效的中和活性，在细胞水平上可有效中和尼帕病毒。其针对的表位不同于已报道的中和表位。因此，该系列抗体有希望成为新的特异的预防与治疗尼帕病毒的抗体药物，为尼帕病毒的防控提供更多选择。为尼帕病毒的防控提供更多选择。


技术研发人员：龚睿 陈荔 邱香果
受保护的技术使用者：中国科学院武汉病毒研究所
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/8/14