一种用于白桦CRIPSR/Cas9基因编辑的启动子及其应用

一种用于白桦cripsr/cas9基因编辑的启动子及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种用于白桦cripsr/cas9基因编辑的启动子及其应用。


背景技术：

2.基因编辑是对基因组特定位置进行修饰的基因工程技术，是基因功能分析和性状改良的重要工具。在已经发现的多种基因编辑技术中，crispr/cas9基因编辑系统由于其设计简单，操作灵活，以及高效的编辑能力，近年来广泛应用于各种生物。
3.在动植物中，为了提高sgrna的表达，小核rna(snrna)基因的poliii启动子，如u3和u6启动子常被用来驱动sgrna。u6snrnas广泛参加核内pre-mrna可变剪切，u3snrnas参与pre-rrna的加工合成。在植物中，u6snrna和u3snrna广泛存在多个复制转录本，其启动子区域包含一个保守的tata盒子和上游序列原件(use)，是转录的关键性元件。启动子转录起始位点明确，u6为“g”，u3为“a”，被认为是crispr/cas9系统中对sgrna精确转录的良好启动子。。
4.双子叶植物和单子叶植物当中普遍应用的分别是拟南芥和水稻的u6和u3启动子。基于这两个模型植物中筛选出的poliii启动子被开发用于多种植物中crispr/cas9系统。
5.近年来，除拟南芥和水稻外其他植物内源特异性启动子也被开发用于crispr/cas9介导的基因编辑，如大豆、棉花、玉米、茄子、小麦、菊苣、番茄、藜麦、苹果和葡萄等。有研究表明，内源poliii启动子能够消除远源不亲和促进sgrna的表达，进而提高基因突变效率。
6.除此之外，7slrna也属于poliii，上游启动子序列中也包含转录关键性元件tata盒子和上游序列原件(use)。
7.白桦，桦木科，桦木属植物，用途极为广泛，其木材可制木器、胶合板材和造纸等；白桦皮能制药；白桦汁液则因富碳水化合物，多种氨基酸及无机盐类等物质，被称为营养丰富的生理活性水；白桦形优美，树干洁白，被广泛用于城市或园林绿化。白桦具有耐寒性能强，扎根深、能在瘠薄土地生存等特点。
8.为了提高白桦营养特性和丰富白桦物种多样性，推动对白桦分子育种的进程，crispr/cas9技术的靶向诱变有可能作为研究白桦基因功能和培育新品种的有效工具。
9.与拟南芥和水稻等一年生植物相比，木本植物的基因功能研究由于营养周期长，遗传转化效率低，自然突变体类型有限等原因难度较大。到目前为止，相关白桦基因的研究使用的敲除载体均由atu6-26启动子驱动sgrna。尽管白桦中已经出现一些创制突变体的办法，仍然缺乏成熟完整的基因编辑体系。


技术实现要素：

10.本发明的目的是提供一种用于白桦cripsr/cas9基因编辑的启动子及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的启动子可提高sgrna的表达量，进而提高基因
的编辑效率。
11.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
12.本发明提供一种用于白桦cripsr/cas9基因编辑的启动子，所述启动子的核苷酸序列如seq id no.1-9和seq id no.11-16中任一项所示。
13.本发明还提上述的供启动子在制备白桦cripsr/cas9基因编辑载体中的应用。
14.本发明还提供一种白桦cripsr/cas9基因编辑载体，包括上述的启动子。
15.本发明还提供一种重组微生物菌株，包括上述的白桦cripsr/cas9基因编辑载体。
16.本发明还提供上述的启动子、白桦cripsr/cas9基因编辑载体或重组微生物菌株在提高白桦的基因编辑效率中的应用。
17.进一步地，所述基因编辑的目的基因为pds基因。
18.本发明还提供一种提高白桦的基因编辑效率的方法，包括将上述的白桦cripsr/cas9基因编辑载体或重组微生物菌株转化入白桦植物组织中的步骤。
19.本发明公开了以下技术效果：
20.本发明首先以白桦植物去烯饱和酶(bppds)基因为靶点，在白桦中尝试了atu6-26启动子和gmu6-5启动子介导的crispr/cas9基因编辑系统，并考察了其基因编辑的有效性和效率。随后，本发明在白桦中鉴定了8个bpu6、7个bpu3和1个bp7sl启动子，以表征它们在白桦crispr/cas9基因编辑系统中的活性。使用本发明提出的白桦启动子可提高sgrna的表达量，进而提高基因的编辑效率。除此之外，本发明还发现转基因t0代白桦可发生双等位突变和纯合突变。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明鉴定出白桦的pds基因与其他植物的pds蛋白序列进行多序列比对；
23.图2为本发明鉴定出的白桦pds基因拥有pds基因专属的两个保守结构域amino_oxidase和nad_binding_8；
24.图3为pds蛋白合成通路图；
25.图4为为本发明设计并筛选出两个基因敲除靶点，分别为sgrna1和sgrna2；
26.图5为将sgrna2连入由patu6-26和pgmu6-5介导的cripsr/cas9基因敲除载体酶切位点和接头(a)和cripsr/cas9基因敲除载体图谱(b)；
27.图6为白桦转基因植株表型图，typei为表型为绿色的转基因植株、typeii为表型为斑白的转基因植株、typeiii为表型为纯白色的转基因植株；
28.图7为白桦合子胚遗传转化流程图；其中a为白桦合子胚共培养；b为白桦愈伤筛选培养；c为白桦转基因苗分化培养；d为白桦转基因苗继代培养；e为白桦转基因苗生根培养；f和g为白桦转基因苗炼化移栽；h为扩摇的工程菌液od
600
＝0.6～1.0；
29.图8为patu6-26和pgmu6-5介导的白桦crispr基因编辑效率柱状图(a)和基因编辑类型大小堆积图(b)；
30.图9为patu6-26和pgmu6-5介导的白桦突变靶点测序，橙色为靶点sgrna序列，灰色为pam序列，黑色破折号为核苷酸缺失、黑色加粗阴影的为核苷酸插入、青色为核苷酸替换，del.为缺失、ins.为插入、rep.为替换，s为同义突变，m为错义突变，n为无义突变；
31.图10为白桦内源u6/u3/7sl启动子序列比对；其中，a：bpu6；b：bpu3；c：bp7sl与拟南芥atu6-26、atu3b和at7sl的snrna序列比对；黑线表示snrna转录本；保守元件use(上游序列元素)和tata-likebox，由u3和u6启动子识别的核苷酸“a”(腺嘌呤)和“g”(鸟嘌呤)被标记在红框中；不同的颜色表示不同级别的序列相似性；100％同一性的核苷酸用黑色突出显示，≥75％和≥50％的核苷酸分别用红色和蓝色突出显示；
32.图11为crispr载体改建过程图；
33.图12为不同启动子(pbpu6-1、pbpu6-2、pbpu6-3、pbpu6-4、pbpu6-5、pbpu6-6、pbpu6-7、pbpu6-8和pbp7sl)载体sgrna接头展示图；
34.图13为不同启动子(pbpu3-1、pbpu3-2、pbpu3-3、pbpu3-4、pbpu3-5、pbpu3-6和pbpu3-7)载体sgrna接头展示图；
35.图14为转基因效率(a)、基因编辑效率(b)、按照dna链的突变进行的基因编辑类型分类(c)和按照蛋白质结构进行的基因编辑类型分类(d)，s为同义突变，m为错义突变，n为无义突变；
36.图15～18为白桦内源启动子突变靶点测序；其中，图15为pbpu6-1～pbpu6-5；图16为pbpu6-6～pbpu6-8；图17为pbp7sl；图18为pbpu3-1～pbpu6-5；图19为pbpu3-6～pbpu3-8，橙色为靶点sgrna序列，灰色为pam序列，黑色破折号为核苷酸缺失、黑色加粗阴影的为核苷酸插入、青色为核苷酸替换，del.为缺失、ins.为插入、rep.为替换；
37.图20为白桦内源启动子基因编辑大小的比率；
38.图21～24为白桦内源启动子突变对应蛋白质结构变化；其中，图21和图22分别为sgrna2的所有突变类型和对应的蛋白质，橙色为靶点sgrna序列，灰色为pam序列，黑色破折号为核苷酸缺失、黑色加粗阴影的为核苷酸插入、青色为核苷酸替换，del.为缺失、ins.为插入、rep.为替换；图23和图24分别为sgrna1的所有突变类型和对应的蛋白质，橙色为突变点之后的蛋白序列，s为同义突变，m为错义突变，n为无义突变；
39.图25为白桦单个愈伤上的转基因苗图。
具体实施方式
40.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
41.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
42.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所
有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
43.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
44.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
45.实施例1patu6-26和pgmu6-5介导的cripsr/cas9能够在白桦中产生靶点突变
46.为了验证crispr/cas9系统是否能在白桦中有效编辑。本发明选择叶绿素合成所必须的白桦去烯饱和酶(birchphytoenedesaturase，bppds)基因作为靶基因(图1)。
47.pds基因所编码的蛋白会对叶绿体起到一种保护作用，当pds基因沉默，叶绿体将会发生氧化降解导致植株发生光漂白现象。这种表型很容易分辨，可直接用肉眼观察，已经在多种植物中得到证明。
48.本发明鉴定出白桦的pds基因，并与其他植物的pds蛋白序列进行多序列比对分析(图1)，结果表明具有高度相似性。本发明预测了这个基因的保守结构域。与前人研究一样，该基因拥有pds基因专属的两个保守结构域amino_oxidase和nad_binding_8(图2)。本发明将这个基因命名为bppds。pds蛋白合成通路图见图3。
49.bppds(genbankaccessionmk455771)是一个长度为11594pb的基因，有13个外显子，1749个核苷酸的转录本序列，编码583个氨基酸。为了敲除该基因，本发明设计并筛选出两个合适的靶点，分别用于u3和u6启动子，分别命名为sgrna1和sgrna2(图4)。
50.在拟南芥中最好的启动子是atu6-26，在大豆中最好的启动子是gmu6-5。
51.本发明将sgrna2连入由patu6-26和pgmu6-5介导的cripsr/cas9基因敲除载体(图5)。
52.本发明将构建好的载体转入eha105农杆菌，采用白桦合子胚的遗传转化方法在白桦中表达crispr/cas9。通过表型观察，本发明发现转基因不定芽中出现明显的白化现象(图6)。
53.eha105农杆菌转化的方法：
54.1.eha农杆菌转化
55.(1)融化农杆菌感受态gv3101(于冰上)，每管加入5μl质粒(1μg左右)，轻轻混匀，冰浴30min。(2)液氮处理5min，37℃水浴5min，加入无抗生素的lb500μl，由于感受态细胞活性所限，28℃振荡孵育4h以上或过夜培养(200rpm)。(3)3000rpm离心1min(4000rpm离心2min)富集后，去上清至剩余80μl左右液体，吸打混匀，涂布于含有rif+kana的lb平板上。(4)28℃培养2天后(农杆菌长势较缓，大约需要培养2d才能长起来)，挑取单克隆放入5mllb(rif+kana)液体培养基中小摇至黄色。(5)液氮处理，-80℃保存菌液。
56.2.阳性菌株的鉴定——菌液pcr鉴定
57.吸取2μl上一步得到的各单克隆培养产物(无菌操作台内操作)，以其为模板进行以上游引物m13-r和sgrna-r为引物的pcr鉴定，选出阳性样品进行下一步操作。由于农杆菌破壁较困难，农杆菌菌液pcr的变性程序为95℃10min。若条带呈阳性，则证明目的片段已连至中载。
58.白桦合子胚遗传转化方法(图7)：
59.1.农杆菌的活化
60.将含有目的基因的农杆菌菌液，加入到含有50mg/l利福平和5mg/l草铵膦的液体lb培养基中，过夜培养。在摇浑的菌液中取少量菌液加到不含抗生素的液体lb培养基中，进行二次活化，待菌液的od
600
在0.6时，作为白桦种子侵染的工程菌。
61.2.白桦种子的处理
62.野生白桦种子采自东北林业大学白桦强化种子园。将种子用自来水冲泡2d，使种子充分吸水膨胀。然后在超净工作台内进行消毒处理，体积分数70％的乙醇浸泡30s，30％(w/v)的过氧化氢溶液浸泡15min，无菌水冲洗3次。
63.3.遗传转化合子胚
64.刀片蘸取菌液对消毒处理后的种子进行纵切，置于不含抗生素的培养基(wpm+2mg/l6-ba+0.2mg/lnaa)中，黑暗条件下共培养2-3d，期间及时更换培养基脱菌。共培养结束后，将农杆菌侵染的合子胚转移至选择培养基(wpm+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+200mg/l头孢霉素+5.5mg/l草铵膦)中筛选抗性愈伤。同时设定阳性和阴性对照，阳性对照，即未用农杆菌侵染的纵切种子在不含抗生素的wpm培养基中培养。阴性对照，即未用农杆菌侵染的纵切种子在含除草剂的选择培养基上培养。
65.4.转基因株系的获得
66.约30天后获得抗性愈伤，将愈伤切开放置在分化培养基上(wpm+0.8mg/l6-ba+0.02mg/lnaa+0.5mg/lga3+200mg/l头孢霉素+5.5mg/l草铵膦)培养不定芽。约30天后，将不定芽切下，插入生根培养基(wpm+0.4mg/liba)，约15天生根，生根之后移栽至温室培养(25℃，16h光照/8h黑暗)，土壤基质(体积比)：草炭土和蛭石体积比为3:1。
67.为了在分子水平上确认基因组编辑并表征突变，并统计每个启动子的编辑效率，本发明从转基因苗中提取基因组dna。使用载体特异性引物m13f/r,sgrna2-r检测其转基因效率，使用靶点特异性引物target2-f/r克隆靶点片段进行测序来鉴定其基因编辑效率和基因编辑类型(表1)。白桦是一个二倍体物种，基因在每个同源染色体上有一个拷贝。因此，crispr/cas9系统可以在目标基因中诱发两种类型的突变。一方面，只有一个等位基因可以被突变，导致导致杂合突变(heterozygous,hz)。这种类型的突变并不能完全敲除目标基因，因为另一个等位基因仍然是野生型。另一方面，两个等位基因都发生突变，如果两个等位基因有相同的突变，那么就是纯合突变(homozygous,hm)，但如果突变不同，就是双等位突变(biallelicmutation,bia)。
68.本发明以一个愈伤组织为单一样品，即这个愈伤组织上面长的所有的苗为单一样品(图25)。
69.为了确定是否为转基因苗，本发明使用载体上的特异性引物(m13r/sgrna2-r)检测基因组。为了确定和描述本发明实验中获得的不同类型的突变，本发明设计了两对特异性引物(bpu6-jd-f/r和bpu3-jd-f/r)扩增两个靶点序列，并对聚合酶链反应(pcr)产物(u6：748bp，u3：719bp)进行了测序。同时本发明克隆靶点连接中载进行测序，来获得不同类型的突变。最后我们统计白桦转基因阳性苗和有突变的苗，拟南芥crispr载体检测51个样品45个阳性苗25个含有突变；大豆crispr载体检测50个样品44个阳性苗14个含有突变，计算出patu6-26和pgmu6-5介导的白桦转基因效率分别为88.2％和88.0％，基因编辑效率分
别为55.56％和31.82％(表4)(图8中a)。结果表明，所有这些具有白化表型的转基因植物都含有pds基因的突变等位基因。
70.patu6-26介导的基因编辑载体所产生的突变中76％bia，16％hm和8％hz。pgmu6-5介导的基因编辑载体所产生的突变中78.57％bia，7.14％hm和14.29％hz(表5)。除此之外，基因编辑类型大部分是小片段的缺失，缺失范围在10～100nts的和插入类型都占很少，说明基因编辑趋向产生小片段的缺失(图8中b和图9)。综上所述，patu6-26和pgmu6-5介导的cripsr/cas9可以在白桦中产生靶点突变，基因编辑效率分别为55.56％和31.82％。同时，从转基因愈伤组织再生的t0代白桦中出现双等位突变和纯合突变的植株。
71.实施例2
72.有研究证明，使用外源启动子会影响crispr-cas9系统中的基因编辑效率。为了表达sgrna，使用rna聚合酶iii启动子，如u6和u3。在u6启动子和u3启动子中，转录本的起始核苷酸分别为“g”和“a”。几个不同的sgrnas可以在一个crispr-cas9系统中共同表达，以同时针对多个dna位点。为了优化白桦基因编辑系统和筛选更多内源高效启动子，本发明在欧洲白桦基因组中进行筛选。
73.本发明使用拟南芥atu6-26，atu3b，at7sl小核rna序列查询，通过筛选本发明获得的，相似性比较高的8个u6序列，7个u3序列和1个7sl序列(命名为bpu6-1～bpu6-8，bpu3-1～bpu3-7，bp7sl)进行下一步分析。bpu6-1如seq id no.1所示，bpu6-2如seq id no.2所示，bpu6-3如seq id no.3所示，bpu6-4如seq id no.4所示，bpu6-5如seq id no.5所示，bpu6-6如seq id no.6所示，bpu6-7如seq id no.7所示，bpu6-8如seq id no.8所示，bpu3-1如seq id no.9所示，bpu3-2如seq id no.10所示，bpu3-3如seq id no.11所示，bpu3-4如seq id no.12所示，bpu3-5如seq id no.13所示，bpu3-6如seq id no.14所示，bpu3-7如seq id no.15所示，bp7sl如seq id no.16所示。这16个基因分布在7条染色体上。
74.结果表明，和前人研究一样，除了表现出相对保守的snrna转录本序列区域，在转录起始位点“g”的-60和-30的位置，包含rna聚合酶-iii启动转录所必需的两个保守元件use和tata-likebox(图10)。用设计的引物把包含这两个保守元件的启动子进行扩增，结果表明扩增的所有序列的长度范围在207bp(bpu3-6)到437bp(bpu6-3)(表2)。
75.本发明的目的是生成含有不同启动子和相应sgrna的一元载体用于白桦基因编辑。为此，本发明改建实验室保存的pgmu6/cas9载体(受赠于南京农业大学喻德跃课题组)，将启动子替换成白桦u6/u3/7sl启动子(表3)，利用原来载体启动子后面的sapi酶切位点，连入相应的sgrnas(图11)。最终，本发明构建了16个不同启动子的针对pds基因的基因编辑载体(图12-13)。
76.实施例3
77.本发明将实施例2构建好的16个载体转入eha105农杆菌(购自上海生工生物工程股份有限公司)，使用农杆菌进行白桦遗传转化(方法参考实施例1)，再生苗中出现了明显白化的表型。同样的使用特异性引物鉴定阳性苗和进行靶点测序。
78.根据转基因鉴定结果，发现所有的载体转基因效率均达到80％以上，与拟南芥和大豆启动子转基因效率差不多，因此我们认为载体启动子的不同并不会影响其转基因效率(图14中a)。但是不同启动子之间基因编辑效率存在明显的差距(图14中b)。除了u3-2，其余的15个载体均出现白色的转基因苗。与检测结果相同，bpu3-2转基因苗中pds基因没有编
辑。
79.纯合在转基因植株中，出现三种不同的表型。与野生型一样的纯绿色，以及有绿色有白色的斑白，最后就是整个植株都呈现白色，叶绿体全部合成失败，也就是bppds基因完全被编辑。我们统计并计算每个载体的基因编辑效率，使用内源启动子介导crispr/cas9基因编辑效率参差不齐，其中基因编辑效率高于patu6-26的有11个启动子，从高到低分别为：bpu6-6:92％、bpu6-2:88.68％、bp7sl:88％、bpu6-8:87.76％、bpu3-3:83.33％、bpu6-5:71.11％、bpu3-4:68％、bpu6-1:62.5％、bpu3-5:60％、bpu3-1:58.33％、bpu6-7:55.81％。11个白桦启动子是patu6-26的1～1.66倍，大大提高了crispr/cas9系统在白桦中的基因编辑效率。有五个启动子的编辑效率大于80％(bpu6-6:92％、bpu6-2:88.68％、bp7sl:88％、bpu6-8:87.76％、bpu3-3:83.33％)，有六个启动子的编辑效率大于55％(bpu6-5:71.11％、bpu3-4:68％、bpu6-1:62.5％、bpu3-5:60％、bpu3-1:58.33％、bpu6-7:55.81％)，剩下的为四个效率低于45％(u3-6:41.5％、u3-7:28.6％、u6-3:20.9％、u6-4:10.9％)(表4)。
80.根据测序结果统计，和patu6-26、pgmu6-5相似，编辑类型主要集中在缺失，缺失大部分集中在1～10nts片段，尤其是bpu6-4编辑类型均是缺失1～10nts。除了bpu6-4之外，其他启动子还包含缺失10～100nts的缺失。另外的突变类型就是核苷酸插入，替换。1nt的替换只有bpu6-2和bp7sl。相对于patu6-26、pgmu6-5缺失nt数，白桦启动子出现了大片段(＞100nts)的缺失，如bpu3启动子中出现的基因编辑中含有大片段缺失，bpu3-3-17缺失358bp的大片段，bpu3-4-26缺失240bp大片段,bpu3-5-17缺失117bp的大片段(图20)。因为在sgrna2中没有出现，我们认为这可能和靶点的选择相关，也有可能是u3启动子活性趋向于产生大片段的缺失。在测序结果中我们发现，一种基因编辑类型根据基因结构被称为缺失-插入(delins-indel)，即一个或多个核苷酸被其他核苷酸替代，我们将这种类型的编辑视为替换，也只出现在了bpu6-1/2/8，bp7sl，bpu3-1/4,且这些启动子活性均高于patu6-26和pgmu6-5，说明内源启动子活性高的同时，更容易产生多种类型的突变(图15～19)。
81.突变材料根据dna双链的突变分类，单链有突变的为杂合突变(heterozygous mutation,hz)，双链有相同突变为纯合突变(homozygousmutation,hm)，双链有不同突变则为双等位突变(biallelicmutation,bia)。有5个内源启动子的杂合突变效率大于75％(u3-7:91.67％、u6-3:88.89％、u6-8:76.74％、u3-6:76.47％、u6-5:75％)，有5个内源启动子的纯合突变效率大于25％(u6-4:40％、u6-1:36.67％、u3-3:35％、u3-5:33.33％、u3-1:28.57％)，有5个内源启动子的双等位突变效率大于10％(u6-4:40％、u6-1:36.67％、u3-3:35％、u3-5:33.33％、u3-1:28.57％)。双等位突变体和纯合突变体是研究基因功能的理想材料，在两个目标位点的期望位置同时检测到突变。根据每个启动子编辑的苗，我们计算出不同编辑类型的占比，可以发现白桦内源启动子的双等位突变体和纯合突变体所占比例大部分都高于patu6-26和pgmu6-5，其中最高的是bpu3-3双等位突变体和纯合突变体一起所占比例为47.50％,是拟南芥的2.04倍。其次为bpu3-5：40.74％(图14中c)。
82.将所有的突变dna链翻译成蛋白质，根据翻译出来的蛋白质不同进行分类(图21～24)，主要有三种突变类型：s：为同义突变(synonymousmutation)，由于密码子的简并性，碱基替换之后密码子的改变不影响原来氨基酸，不影响编码效率。m：错义突变(missensemutation)，编码氨基酸的碱基替换成另外一种密码子，从而是多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。n：无义突变(nonsensemutation)，终止密码子也称为无义密码子(包
括uaa、uag、uga)，无义突变指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。时常导致蛋白质功能的丧失。根据材料的重要性，我们只在双等位突变体和纯合突变体中统计，除此之外由于a的类型只有一个，因此我们将a的占比忽略不计。将转基因植株按照书双链的类型分类：“+/m,+/n,m/m,n/n,bm/n”这五种类型。根据统计结果，卡方检验其显著性，“m/n”和“n/n”占比多的有bpu3-3,bpu3-7和bpu3-1是拟南芥启动子的1～2倍。此外单独看“n/n”类型，bpu3-3、bpu3-1、bpu6-1、bpu3-4和bpu3-5占比也是拟南芥patu6-26和大豆pgmu6-5的1～2倍。这些结果说明，白桦内源pol-iii启动子能够提高基因编辑效率同时更倾向对研究有利突变(图14中d)。
83.本发明发现内源启动子能够在白桦中产生靶点突变，并且突变效率远远高于本发明预期。
84.综上所述，本发明发现patu6-26、pgmu6-5与内源启动子相比转基因效率没有明显差距，这也说明了启动子的更换不影响植物遗传转化效率。然而，白桦内源启动子在基因编辑效率上显著高与patu6-26和pgmu6-5。
85.总之，本发明筛选了16个白桦内源启动子，其中有15个启动子拥有活性，11个启动子的活性较高，与patu6-26和pgmu6-5对比来说可以提高基因的编辑效率1～1.66倍。
86.表1sgrna和靶点鉴定引物
[0087][0088][0089]
表2白桦内源u6/u3/7sl启动子克隆引物
[0090][0091]
表3白桦内源u6/u3/7sl启动子连接引物
[0092]
[0093][0094]
表4bppds基因的转基因效率和基因编辑效率
[0095][0096]
注：转基因效率：阳性苗占总检测数量的比率；基因编辑效率：突变植株占阳性苗的比率。
[0097]
表5bppds基因编辑类型分类和统计
[0098]
[0099]
注：根据突变后的蛋白质结构分类，并算出“bb”,“bc”和“cc”在纯合和双等位突变中所占比率，hm：纯合突变体；hz：杂合突变体；bia：双等位突变。b，错义突变，c，无义突变，no，数量。
[0100]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种用于白桦cripsr/cas9基因编辑的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如seq id no.1-9和seq id no.11-16中任一项所示。2.一种如权利要求1所述的启动子在制备白桦cripsr/cas9基因编辑载体中的应用。3.一种白桦cripsr/cas9基因编辑载体，其特征在于，包括权利要求1所述的启动子。4.一种重组微生物菌株，其特征在于，包括权利要求3所述的白桦cripsr/cas9基因编辑载体。5.一种如权利要求1所述的启动子、如权利要求3所述的白桦cripsr/cas9基因编辑载体或如权利要求4所述的重组微生物菌株在提高白桦的基因编辑效率中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因编辑的目的基因为pds基因。7.一种提高白桦的基因编辑效率的方法，其特征在于，包括将如权利要求3所述的白桦cripsr/cas9基因编辑载体或权利要求4所述的重组微生物菌株转化入白桦植物组织中的步骤。

技术总结
本发明公开了一种用于白桦CRIPSR/Cas9基因编辑的启动子及其应用，涉及基因工程技术领域。所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-9和SEQ ID NO.11-16中任一项所示。本发明在白桦中鉴定了8个BpU6、7个BpU3和1个Bp7SL启动子，以表征它们在白桦CRISPR/Cas9基因编辑系统中的活性。使用本发明提出的白桦启动子可提高sgRNA的表达量，进而提高基因的编辑效率。除此之外，本发明还发现转基因T0代白桦可发生双等位突变和纯合突变。等位突变和纯合突变。等位突变和纯合突变。


技术研发人员：郑志民 程大伟 张庆祝 姜静 刘桂丰 曹乐生 张中良 娄伟平
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/14