一种中华绒螯蟹小热休克蛋白20在抗干露胁迫中的应用的制作方法

no.2所示。
11.作为进一步改进的，在干露胁迫下，给中华绒螯蟹注射中华绒螯蟹小热休克蛋白20。
12.作为进一步改进的，所述注射中华绒螯蟹小热休克蛋白20的剂量为每克体重0.4-1.0mg。
13.一种中华绒螯蟹抗干露增强剂，包括中华绒螯蟹小热休克蛋白20。
14.作为进一步改进的，所述中华绒螯蟹小热休克蛋白20为中华绒螯蟹小热休克蛋白20基因编码蛋白的重组表达产物。
15.作为进一步改进的，还包括中华绒螯蟹小热休克蛋白20的保存剂。该保存剂能够防止中华绒螯蟹小热休克蛋白20变性，延长其保存时间。
16.一种中华绒螯蟹小热休克蛋白20在降低中华绒螯蟹组织中的丙二醛含量中的应用。丙二醛(malondialdehyde，mda)是自由基引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，其含量的高低反映了细胞膜氧化损伤的程度。
17.作为进一步改进的，所述中华绒螯蟹组织为中华绒螯蟹的肝胰腺、鳃以或血淋巴。
18.本发明的有益效果是：
19.本发明的中华绒螯蟹小热休克蛋白eshsp20的重组蛋白，能够缓解干露胁迫下机体的氧化损伤，具有作为中华绒螯蟹抗干露能力增强剂的广阔应用前景，对于解决中华绒螯蟹养殖和运输过程中面临的干露胁迫问题具有重要意义。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
21.图1为本发明实施例1提供的中华绒螯蟹小热休克蛋白eshsp20基因orf的cdna序列及编码的氨基酸序列。其中蓝色字母表示起始密码子，红色字母表示终止密码子，绿色阴影表示hsp20结构域。
22.图2为本发明实施例2提供的中华绒螯蟹小热休克蛋白eshsp20的组织表达谱(a)以及在干露胁迫下的表达量变化(b)。(a)中不同字母表示不同组织间的表达量差异显著(p《0.05)。(b)中*表示实验组与对照组间eshsp20表达量的显著差异(p《0.05)。
23.图3为本发明实施例3提供的中华绒螯蟹小热休克蛋白eshsp20基因所编码的重组蛋白。图中a，b分别为纯化重组蛋白的sds-page分析和western blot分析。m：蛋白质分子量标准(kda)；lane 1：his-trx；lane 2：his-eshsp20。
24.图4为本发明实施例4提供的干露胁迫和注射eshsp20重组蛋白对中华绒螯蟹肝胰腺(a)、鳃(b)、血清(c)中mda含量的影响。不同字母表示不同实验组间的mda含量差异显著(p《0.05)。
具体实施方式
25.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施
方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1
27.中华绒螯蟹基因组(ncbi检索号：lqif00000000)数据获知中华绒螯蟹小热修休克蛋白eshsp20基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示：
28.atgaactctccactcatccaacaagatggtgactgcaaacaactgaaacttcgatttgatgttagccagtacaagcctgaggagattgtcgtcaaaactgtcgataacaagctattggttcatgccaaacatgaagagaagagtgactgcaggtctgtttatcgtgaatacaacagagaatttttgctccccaaaggcactaatcctgaactcatcaagtcctcgctctccaaagatggagtgttgacggtggaatctcctctccctgccattgctggaaacgaagaaaaagtcattcctattgctcagcactaa。
29.eshsp20所述的氨基酸序列如seq id no.2所述。
30.mnspliqqdgdckqlklrfdvsqykpeeivvktvdnkllvhakheeks dcrsvyreynrefllpkgtnpeliksslskdgvltvesplpaiagneekvipia qh。
31.eshsp20基因的orf为315bp，编码一个104个氨基酸的多肽，预测分子量为11.79kda。eshsp20氨基酸序列具有hsp20结构域(q
8-a
102
)。
32.本发明中eshsp20基因orf的cdna克隆具体操作如下。
33.选取5只正常的中华绒螯蟹，使用5ml的无菌注射器抽取血淋巴(血淋巴与抗凝剂之比为1：1)，4℃、800g离心5min收集血细胞。解剖螃蟹，采集胸神经节、肝胰腺、胃、心脏、精巢、鳃、肌肉、眼柄和脑组织，将样品置于rnaiso plus(宝日医生物技术有限公司，日本)中进行裂解并提取rna，使用primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser(宝日医生物技术有限公司，日本)试剂盒进行反转录得cdna。
34.使用primer premier 5.0设计pcr引物，扩增eshsp20的orf序列。含酶切位点的特异性引物分别eshsp20-ecor
ⅰ‑
f(5’ccggaattcatgaactctccactcatccaac 3’，seq id no.3)和eshsp20-hind
ⅲ‑
r(5’cccaagcttttagtgctgagcaataggaatg 3’，seq id no.4)。以中华绒螯蟹肝胰腺cdna为模板进行pcr扩增，pcr反应体系如下：
[0035][0036]
pcr反应条件如下：1)95℃5min；2)35个循环：95℃30s，58℃30s，72℃1min；3)72℃10min；4)4℃pause。
[0037]
琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，将大小与预期相吻合的条带切下，依照dna产物纯化试剂盒说明书回收目的片段。将纯化后的目的片段连接至pmd
tm 19-t载体，16℃下连接12h，连接体系如下：
[0038][0039]
将10μl的连接产物加入到50μl感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min后加入500μl的无抗性lb液体培养基。37℃ 200g培养1h。取100μl菌液涂布于含氨苄青霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养12h。挑取单一菌落进行菌落pcr。使用琼脂糖凝胶电泳检测载体中插入的基因片段大小与目的基因是否一致，将大小一致的菌株进行桑格测序。测序结果与eshsp20基因序列比对确认。
[0040]
实施例2
[0041]
利用实时定量pcr测定eshsp20的组织分布及干露胁迫后表达量变化的具体实施方式如下。
[0042]
根据seq id no.1序列设计荧光定量引物，eshsp20-rt-f(5’gcaggtctgtttatcgtg 3’，seq id no.5)和eshsp20-rt-r(5’tcttcgtttccagcaat 3’，seq id no.6)。通过荧光定量pcr绘制引物扩增的标准曲线，求得引物的扩增效率，并根据融解曲线判断扩增产物的特异性。以不同组织(肝胰腺、鳃、肠、胃、心、肌肉、胸神经节、眼柄、血细胞、精巢)的cdna为模板(制备方法同实施例1)，检测eshsp20在不同组织中的mrna表达水平。以β-actin作为内部标准化的参考基因，每个样品3次技术重复。用干露胁迫后的中华绒螯蟹肝胰腺cdna为模
板，检测eshsp20的mrna表达水平变化，以β-actin作为内部标准化的参考基因，每个样品3次技术重复。qrt-pcr运行程序如下：1)95℃ 30s；2)40个循环：95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 30s；3)熔解曲线分析：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 30s，60℃ 15s。反应体系如下表：
[0043][0044]
使用2-δδct
法计算eshsp20的mrna相对表达水平。实验数据均表示为平均值
±
标准差。使用spss 17.0软件进行单因素方差分析，检验数据差异显著性，p《0.05表示差异显著。
[0045]
实验结果如图2所示，由图2可知，eshsp20在所有10种被测组织中均有表达。eshsp20主要在肌肉中表达，其次是心脏和、胃。在干露胁迫12h、24h后，肝胰腺中eshsp20的表达水平均显著上调(p《0.05)，分别增加2.13倍和2.02倍。
[0046]
实施例3
[0047]
获得eshsp20重组蛋白的具体实施方式如下。
[0048]
以实施例1同样的方法进行pcr反应。将pet-32a质粒和eshsp20的pcr产物分别用ecorⅰ和hindⅲ进行酶切，在37℃下，水浴3h，酶切体系如下：
[0049][0050][0051]
用1.0％琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行分离，并切胶回收；将酶切后的回收产物按以下体系进行连接，16℃水浴连接12h；
[0052][0053]
将连接产物转化到感受态细胞dh5α中，加入500μl无抗性的lb液体培养基，37℃、200g培养1h，将菌液涂布于含氨苄青霉素抗性的lb固体培养基上，37℃培养12h。使用t7通用引物，通过菌落pcr鉴定目的序列片段是否插入到pet-32a质粒，将成功插入的菌株进行桑格测序。
[0054]
将构建成功的重组质粒转化到e.coli bl21(de3)plyss感受态细胞中，加入500ml含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基，37℃、200g培养至od600＝0.6。在菌液中加入10μl 0.1mm iptg，在18℃、200g条件下培养12h。10000g离心3min，弃上清。将菌体重悬于25ml 1
×
pbs中，加入25μl 10mm pmsf。超声破碎菌体，功率30％，每工作3s暂停2s，总时长30min。11000g离心20min，收集上清液。
[0055]
吸取8ml ni-nta 6ff琼脂糖纯化树脂到50ml离心管中，加入25ml pbs，轻微颠倒混匀，500g离心30s，弃上清。清洗步骤重复5遍。加入300ml蛋白上清液，在4℃下，摇晃孵育2h。将蛋白上清液和ni-nta 6ff琼脂糖纯化树脂转移到蛋白纯化柱中，滤去上清液。依次用60ml的20mm、50mm、100mm、200mm、300mm和500mm 6种不同浓度的咪唑溶液洗脱ni-nta 6ff琼脂糖纯化树脂上的蛋白质，收集洗脱液，每个浓度的洗脱液分装在6个15ml管中。使用sds凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测收集到的洗脱液中目的重组蛋白的纯度。
[0056]
如图3所示，使用原核表达系统和亲和层析技术成功获得了eshsp20的重组蛋白(his-eshsp20)，his-eshsp20的分子量大小约为34kda。
[0057]
实施例4
[0058]
实验设置干露饲养组、干露饲养+注射eshsp20组、水环境饲养组和水环境饲养+注射eshsp20组，每组6个生物学重复。干露饲养为纯干露环境饲养，每只螃蟹体重为30-50g，每只螃蟹注射浓度为200ng/μl的eshsp20的蛋白100μl。注射eshsp20重组蛋白后将螃蟹置于各实验条件下饲养，在注射eshsp20重组蛋白6h、12h、24h后取肝胰腺、鳃、血淋巴，并将肝胰腺和鳃制备成组织匀浆。组织匀浆处理方式为，取组织经液氮研磨后称重，按1:9(w/v，g/l)的比例加入预冷的生理盐水，低温混匀，2500g离心10min，保留上清，用于测定丙二醛含量。丙二醛(malondialdehyde，mda)是自由基引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，其含量的高低反映了细胞膜氧化损伤的程度，常被用来衡量干露胁迫对生命体的损伤程度。
[0059]
中华绒螯蟹肝胰腺、鳃、血淋巴中丙二醛含量测定的具体实施方式如下：
[0060]
按照丙二醛(mda)测定试剂盒(tba法)(南京建成生物工程研究所，中国)说明书准备待测样品，将样品置于95℃水浴40min，冷却后3500g离心10min，在波长532nm处测定吸光值。mda含量计算：组织中mda含量(nmol/mgprot)＝(测定od值-对照od值)/(标准od值-空白od值)
×
标准品浓度(10nmol/ml)/组织匀浆液蛋白浓度(mgprot/ml)。实施例结果如图4所示。
[0061]
由图4可知，mda含量的测定结果显示，干露饲养组在干露6h、12h和24h时，中华绒螯蟹肝胰腺中mda的含量显著高于水环境饲养组，分别是水环境饲养组的2.90倍、4.39倍和3.28倍；干露饲养+eshsp20注射组在干露6h和12h时，中华绒螯蟹肝胰腺中mda的含量与水环境饲养组无显著差异，在干露24h时肝胰腺中mda的含量相较于水环境饲养组显著增大，是水环境饲养组的2.50倍；水环境饲养+eshsp20注射组的肝胰腺mda含量在各时间点与水环境饲养组均无显著差异；干露饲养组的肝胰腺mda含量在各时间点均显著高于干露饲养+eshsp20注射组，依次是干露饲养+eshsp20注射组的1.69倍、3.47倍和1.31倍。
[0062]
中华绒螯蟹的鳃中mda的含量显著高于水环境饲养组，分别是水环境饲养组的1.89倍、2.49倍和2.08倍；干露饲养+eshsp20注射组在干露6h和12h时，中华绒螯蟹鳃中mda的含量与水环境饲养组无显著差异，在干露24h时鳃中mda的含量相较于水环境饲养组显著增大，是水环境饲养组的1.45倍；水环境饲养+eshsp20注射组的鳃mda含量在各时间点与水环境饲养组均无显著差异；干露饲养组的鳃mda含量在各时间点均显著高于干露饲养+eshsp20注射组，依次是干露饲养+eshsp20注射组的1.31倍、2.12倍和1.44倍。
[0063]
中华绒螯蟹血淋巴中mda的含量显著高于水环境饲养组，分别是水环境饲养组的1.11倍、1.63倍和2.14倍；干露饲养+eshsp20注射组在干露6h和12h时，中华绒螯蟹血淋巴中mda的含量与水环境饲养组无显著差异，在干露24h时血淋巴中mda的含量相较于水环境饲养组显著增大，是水环境饲养组的1.54倍；水环境饲养+eshsp20注射组的血淋巴mda含量在各时间点与水环境饲养组均无显著差异；干露饲养组的血淋巴mda含量在各时间点均显著高于干露饲养+eshsp20注射组，依次是干露饲养+eshsp20注射组的1.33倍、1.41倍和1.54倍。
[0064]
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种中华绒螯蟹小热休克蛋白20在抗干露胁迫中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中华绒螯蟹小热休克蛋白20的基因核苷酸序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中华绒螯蟹小热休克蛋白20的氨基酸序列如seq id no.2所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在干露胁迫下，给中华绒螯蟹注射中华绒螯蟹小热休克蛋白20。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述注射中华绒螯蟹小热休克蛋白20的剂量为每克体重0.4-1.0mg。6.一种中华绒螯蟹抗干露增强剂，其特征在于，包括中华绒螯蟹小热休克蛋白20。7.根据权利要求6所述的中华绒螯蟹抗干露增强剂，其特征在于，所述中华绒螯蟹小热休克蛋白20为中华绒螯蟹小热休克蛋白20基因编码蛋白的重组表达产物。8.根据权利要求6所述的中华绒螯蟹抗干露增强剂，其特征在于，还包括中华绒螯蟹小热休克蛋白20的保存剂。9.一种中华绒螯蟹小热休克蛋白20在降低中华绒螯蟹组织中的丙二醛含量中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述中华绒螯蟹组织为中华绒螯蟹的肝胰腺、鳃以或血淋巴。

技术总结
本发明提供一种中华绒螯蟹小热休克蛋白20在抗干露胁迫中的应用。所述中华绒螯蟹小热休克蛋白20的基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，在干露胁迫下，给中华绒螯蟹注射中华绒螯蟹小热休克蛋白20，能够缓解干露胁迫下机体的氧化损伤，中华绒螯蟹小热休克蛋白20具有作为中华绒螯蟹抗干露能力增强剂的广阔应用前景。中华绒螯蟹抗干露能力增强剂的广阔应用前景。中华绒螯蟹抗干露能力增强剂的广阔应用前景。


技术研发人员：崔朝霞 倪孟琦 郑锦滨 杨亚男
受保护的技术使用者：连云港十足目生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/8/14