一种miR-5120的应用的制作方法

一种mir-5120的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种mir-5120的应用。


背景技术：

2.代谢相关性脂肪性肝病(metabolic-dysfunction-associated fatty liver disease，mafld)，是以肝细胞脂肪过量堆积为病理特征的慢性肝病。mafld是一种代谢性相关肝损伤，诊断标准是基于肝组织学活检、影像学及血液生物标志物证据，同时合并以下三项条件之一：超重/肥胖、2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，t2dm)、代谢功能障碍。大数据显示mafld患病率仍处于持续上升阶段，并且呈现年轻化、大众化趋势。其次，mafld死亡率也在显著增加。mafld不仅导致肝脏炎症、纤维化和恶性肿瘤的发生，而且常合并多种代谢紊乱，会引起痛风、t2dm、高血压乃至心脑血管动脉粥样硬化等重大疾病。因此，对mafld的早诊断及早治疗极其重要。
3.目前肝脏超声是最广泛用于mafld诊断的临床方法，然而超声的灵敏度有限，不能可靠地检测到《20％的肝脏脂肪变性；近年来，在临床工作或科研中，越来越多地采用瞬时弹性超声成像(fibroscan)技术来评估肝脏脂肪变性。有研究表明，使用肝脏组织活检结果作为参考标准，fibroscan技术诊断的受试者特征曲线下的面积为0.70；但该项技术需要配备专用设备，对操作人员也需要一定的准入标准，因此不利于临床大范围推广。
4.计算机断层扫描(computed tomography，ct)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)也可用于诊断中度和重度mafld；磁共振光谱学(mrs)提供肝脏脂肪的定量估计，但是价格昂贵，可用性有限，并且需要特殊的软件。血清标志物能够满足操作简单、价格低廉、检测准确等要求，因此更有利于在广大基层医院的临床推广应用，但目前尚缺乏有效的血清标志物用于早期诊断mafld。
5.越来越多的研究认为，mirna是包括肥胖症，t2dm和mafld在内的代谢疾病的关键因子。既往研究已经证实，mirna可以稳定存在于血液、尿液、唾液等多种体液中，并且在多种疾病中随着疾病的发生发展而发生特异性改变，因此，mirna被认为可以作为疾病的临床诊断标志物及治疗靶点。此外，由于mirna的变化早于蛋白水平的变化，因此体液mirna可以作为疾病的早期诊断标志物，有助于疾病的早发现和早治疗。已有多项研究发现mirna参与了mafld的发病机制，其中的数个mirna，例如mir-122、mir-33、mir-34a和mir-21，有可能用于mafld的诊断；但上述研究结果并不一致，至今为止，尚无公认的用于mafld早期诊断的mirna。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种mir-5120的应用。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
8.本发明的第一方面是提供一种检测mir-5120的试剂在制备诊断肝病试剂盒中的应用。
9.优选地，所述mir-5120为血清mir-5120。
10.优选地，所述mir-5120的序列如seq id no:1(uuuggggcuguggugccaccagc)所示。
11.优选地，所述肝病为慢性肝病。
12.更优选地，所述慢性肝病为代谢相关性脂肪性肝病。
13.优选地，所述试剂盒包括：所述血清mir-5120的引物序列。
14.更优选地，所述引物序列如seq id no:2-4所示。
15.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
16.本发明针对代谢相关性脂肪性肝病早期诊断困难的现状，提出了血清mir-5120可以作为代谢相关性脂肪性肝病的早期诊断标志物，从而实现代谢相关性脂肪性肝病的早发现，有效改善预后。
附图说明
17.图1为代谢相关性脂肪性肝病小鼠的肝脏表型；其中，图1a为对照组小鼠的肝脏表型；图1b为mafld组小鼠的肝脏表型；图1c为小鼠体重变化图；
18.图1d为小鼠血糖变化图；图1e为小鼠末次体重；图1f为小鼠肝重；图1g为小鼠血清alt水平；图1h为小鼠血清ast水平；图1i为小鼠血清tg水平；图1j为小鼠血清tc水平；图1k为小鼠血清ldl水平；图1l为小鼠肝脏组织tg水平；图1m为对照组小鼠肝脏组织he染色图；图1n为mafld组小鼠肝脏组织he染色图；图1o为对照组小鼠肝脏组织油红o染色图；图1p为mafld组小鼠肝脏组织油红o染色图；图1q为对照组小鼠肝脏组织天狼星红染色图；
19.图1r为mafld组小鼠肝脏组织天狼星红染色图；图1s为胶原沉积半定量；数值以均数
±
标准差表示；与对照组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
20.图2为mafld组小鼠血清及肝脏mir-5120表达水平的改变；其中，图2a为小鼠血清mir-5120表达；图2b为小鼠肝脏mir-5120表达；数值以均数
±
标准差表示；与对照组比较，*p《0.05，***p《0.001。
21.图3为ffa联合hg刺激hepa1-6肝细胞48小时后细胞上清液及细胞中mir-5120表达水平的变化；其中，图3a为细胞上清液中mir-5120表达；图3b为hepa1-6肝细胞中mir-5120表达；数值以均数
±
标准差表示；与对照组比较，**p《0.01，***p《0.001。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
24.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
25.实施例
26.鼠源性mir-5120与人源性mir-5120序列高度保守，故实施例中采用鼠源性mir-5120序列；
27.一、mafld小鼠模型的构建
28.将购置的c57bl/6j(n＝20)8周龄雄性小鼠分笼饲养于同济大学沪北校区的实验动物中心，予spf级环境，每日光照12小时并保持温度21℃
±
4℃，湿度55％
±
20％，自由饮水和进食，普通饲料适应性喂养1周后将小鼠随机分为正常对照组(control组，n＝10)和mafld组(n＝10)；control组予普通饲料(含脂肪6％)喂养，mafld组用高脂饲料(含脂肪42％)喂养；喂养4周后，mafld组小鼠予链脲佐菌素(stz)100mg/kg一次性腹腔注射，后继续高脂饲料喂养；control组予同体积柠檬酸缓冲液腹腔注射，后继续普通饲料喂养；stz注射1周后对小鼠进行剪尾取血，用强生血糖仪测定空腹血糖；mafld小鼠模型造模成功的血糖标准为空腹血糖》11.1mmol/l；所有小鼠在过夜禁食12h后的情况下，每周对其体重以及血糖进行测量和记录，继续喂养18周后收取血清及肝脏组织样本。
29.二、高糖高脂刺激肝细胞株hepa1-6细胞模型的构建
30.将肝细胞株hepa1-6分为正常对照组(control组)及高脂高糖组(ffa+hg组)；将培养好的细胞以1
×
105个/孔的密度平铺在六孔板中，每组均设三复孔，每孔加入2ml培养基。mem培养基(含5.5mm葡萄糖)培养1天后细胞贴壁生长，两组均将培养基更换为含0.2％牛血清蛋白(bull serum albumin，bsa)的mem培养基(不加fbs)进行饥饿12小时，各组药物干预如下：
31.(1)control组：加入mem培养基1.8ml，同时加入10％的bsa 200μl作为空白对照，继续培养48小时收取细胞和细胞上清；
32.(2)ffa+hg组：取200μl的ffa加入hg-dmem(含30mm葡萄糖)培养基中，培养48小时收取细胞和细胞上清。
33.三、抽提血清或上清mirna
34.对小鼠空腹静脉采血，分离血清，冻存于-80℃备用。使用mircute血清/血浆mirna分离试剂盒(tiangen)提取总血清mirna。抽提所需包括：裂解液mz，漂洗液rw，去蛋白液mrd，rnase-free ddh2o，无水乙醇，氯仿，吸附柱mirspin，吸附柱mirelute，rnase-free离心管，rnase-free收集管。
35.抽提步骤如下：
36.1.每200μl血清中加入200μl裂解液mz，振荡器振荡混匀30sec。
37.2.室温放置5min后，室温13,400
×
g离心10min，取上清，转入一个新的无rnase的离心管中。
38.3.加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。而后室温13,400
×
g离心15min，样品会分成三层(黄色的有机相，中间层和无色的水相)，把水相转移到新管中。
39.4.量取转移液的体积，缓慢加入转移液1/3体积的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱mirspin，室温放置2min，室温13,400
×
g离心30sec，离心后弃掉吸附柱mirspin，保留流出液。
40.5.量取流出液的体积，缓慢加入流出液2/3体积的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱mirelute，室温放置2min，室温13,400
×
g离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱mirelute。
41.6.向吸附柱mirelute中加入500μl去蛋白液mrd，室温静置2min，室温13,400
×
g离心30sec，弃废液。
42.7.向吸附柱mirelute中加入600μl漂洗液rw，室温静置2min，室温13,400
×
g离心30sec，弃废液。重复该漂洗操作一次。
43.8.将吸附柱mirelute放入2ml收集管中，室温13,400
×
g离心1min，去除残余液体。
44.9.将吸附柱mirelute转入一个新的rnase-free 1.5ml离心管中，加15-30μl rnase-free ddh2o，室温放置2min，室温13,400
×
g离心2min。
45.四、逆转录
46.使用primescript rt试剂盒(takara)对血清mirna进行逆转录。所需材料包括：反转录的5
×
buffer、逆转录酶、rnase-free water、recombinant ribonuclease inhibitor(rri)、rt primer(浓度10μm)
[0047][0048]
反应程序：42℃15min，95℃3min，16℃forever。将cdna稀释至45μl后进行下一步实验。
[0049]
五、qpcr
[0050]
使用sybr premix ex taq试剂盒(takara)通过abi实时系统pcr仪器(applied biosystems)进行定量分析。
[0051][0052]
反应程序：95℃10min；
[0053]
95℃30sec，60℃30sec，72℃30sec(45个循环)；
[0054]
melting curve。
[0055]
六、计算mirna的表达量
[0056]
用mir-16作为内参。阈值循环(ct)值大于35视为未检出。每个mirna的相对表达量表示为2-[ct(mirna)-ct(mir-16)]
。
[0057]
上述反应体系中各引物序列如下表所示：
[0058][0059]
七、结果
[0060]
与正常对照组(control组)相比，mafld组小鼠不仅血糖、体重和肝重均明显增加(图1c-1f)，肝脏形态增大，颜色稍偏黄，边缘变钝(图1a-1b)，并且肝脏he及油红o染色提示肝脏结构紊乱，胞质中可见融合成片的脂肪空泡样变性以及水样变性，红色脂滴堆积(图1m-1p)。mafld组小鼠肝脏天狼星红染色可见胶原纤维的沉积增多(图1q-1s)。此外，mafld组小鼠肝功能、血脂以及肝脂水平，包括丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，alt)、甘油三酯(triglyceride，tg)、胆固醇(cholesterol，tc)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，ldl-c)以及肝脏组织tg均明显高于control组(图1g-1l)。以上结果均提示mafld小鼠模型构建成功。
[0061]
而后，与对照组相比，mafld组小鼠的血清mir-5120水平显著降低(图2a)，并且mafld组小鼠肝脏组织中mir-5120表达水平也显著降低(图2b)。
[0062]
为了进一步证实mafld小鼠模型中降低的血清mir-5120水平与代谢相关性脂肪性肝病发病的相关性，用ffa联合hg直接刺激肝细胞株hepa 1-6构建mafld细胞模型后，再次检测肝细胞及细胞上清中mir-5120的表达；发现高糖高脂刺激后的肝细胞hepa 1-6的上清液和细胞内的mir-5120表达较对照组均显著降低(图3a-3b)。
[0063]
以上结果提示，血清mir-5120可以作为代谢相关性脂肪性肝病的早期诊断标志物。
[0064]
综上所述，本发明提出了血清mir-5120可以作为代谢相关性脂肪性肝病的早期诊断标志物，从而实现代谢相关性脂肪性肝病的早发现，有效改善预后。
[0065]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种检测mir-5120的试剂在制备诊断肝病试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-5120为血清mir-5120。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-5120的序列如seq id no:1所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝病为慢性肝病。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述慢性肝病为代谢相关性脂肪性肝病。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：所述血清mir-5120的引物序列。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物序列如seq id no:2-4所示。

技术总结
本发明涉及一种检测miR-5120的试剂在制备诊断肝病试剂盒中的应用；本发明针对代谢相关性脂肪性肝病早期诊断困难的现状，提出了血清miR-5120可以作为代谢相关性脂肪性肝病的早期诊断标志物，从而实现代谢相关性脂肪性肝病的早发现，有效改善预后。有效改善预后。有效改善预后。


技术研发人员：李然 薛莹 张克勤 叶正芹 周筠 方萍 宗冠男 胡珂榕 徐威 孔德鸿
受保护的技术使用者：上海市同济医院
技术研发日：2022.08.29
技术公布日：2023/8/23