一种提高3D光打印分辨率的生物墨水添加剂及其应用

一种提高3d光打印分辨率的生物墨水添加剂及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种提高3d光打印分辨率的生物墨水添加剂及其应用。


背景技术：

2.在3d生物打印方法中，3d光打印可以提高制作速度、图案保真度和细胞存活率。3d光打印包括立体光刻(sla)、数字光处理(dlp)、双光子聚合(2pp)、计算轴向光刻(cal)和光固化挤出打印。像2pp和cal这样的技术需要先进的光学元件或独特的化学物质，通用性和可应用性较差。光固化挤出打印可能会降低细胞活力，打印速度和分辨率相对较低，当从喷嘴挤压时，细胞会受到剪切力。sla提供了高打印分辨率，但打印效率较低。dlp具有令人满意的打印速度、分辨率，并能细胞活力同时生成复杂的结构，因此被广泛用于生物医学研究。
3.对于以dlp、sla为代表的3d光打印，在不依赖双光子系统等高级光学仪器时，打印分辨率受到墨水材料性质影响明显。目前，用于3d光打印的大多数墨水是光活性生物材料，在光引发的自由基聚合作用下交联成水凝胶。常用的有甲基丙烯酸生物大分子，如silma(丝纤维甲基丙烯酸盐)和hama(透明质酸甲基丙烯酸盐)是广泛使用的光活性生物材料，甲基丙烯酰化明胶(gelma)是3d生物打印最常用的墨水之一。其他光固化生物相容性材料，如聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)，也因其优异的稳定性而得到广泛应用。然而使用传统生物墨水进行高分辨率打印非常困难，因为在打印过程中会产生不需要的自由基，该自由基会在未光照暴露区域发生聚合，从而导致过度固化，极大影响了分辨率。
4.为了确保3d光打印的高分辨率，常用方法是加入添加剂。添加剂一般为小分子化学物质，也包括一些纳米粒子，根据原理可以分为光抑制剂、自由基清除剂、光吸收剂等。其中光抑制剂通过光激发产生可以终止链生长的自由基来调控自由基聚合；自由基清除剂通过直接与反应体系中的自由基反应从而限制自由基扩散及聚合；光吸收剂通过吸收多余的光，从而提高光聚合起始的曝光剂量来提高光聚合分辨率。由于多数添加剂有细胞毒性，因此生物光打印中常用的添加剂多数为染料类光吸收剂，如柠檬黄、酚红、伊红等，可减少衍射光，从而减少迁移的自由基。添加光吸收剂虽然对减少自由基提高分辨率有作用，但由于其细胞毒性，在生物打印中的应用有限。最近，grigoryan及其同事将食用染料柠檬黄应用于pegda水凝胶中，成功地提高了z方向分辨率，具有良好的细胞相容性，然而这种方法仍然面临使用光吸收剂的常见问题：在优化曝光剂量以提高分辨率时，打印输出的机械性能会受损。此外，小分子添加剂在使用过程中，爆释和跨细胞膜扩散都可能会对包裹的细胞和附近的细胞产生潜在不良生物学问题。
5.因此，针对现有技术的缺点：1、能够高分辨率3d打印的技术往往不能支持载细胞打印，而可以保持载细胞活性打印的体系，打印分辨率很难达到100微米以下；2、现有添加剂均为小分子，小分子容易透过细胞膜进入细胞，同时打印产物会有小分子爆释，二者均易造成不良生物学影响；3、现有的添加剂在增加打印分辨率的同时会往往会使材料的交联程度降低，从而降低打印产品的机械强度。
6.因此急需找到一种既能提高3d光打印分辨率，同时还能保证机械强度和生物相容性的大分子生物墨水添加剂，才能更好地进行组织和器官的重建以及促进体内仿生研究模型的开发和发展。


技术实现要素：

7.为解决上述问题，本发明提供了一种能够有效提高3d光打印分辨率的生物墨水添加剂及其应用，通过将邻硝基苯甲醇衍生物(nb)接枝到天然生物大分子(如硫酸软骨素(cs))上，合成了一种新型生物墨水添加剂，其能通过抑制光引发过程中未曝光区域的自由基聚合，将打印分辨率提高到10μm级别，可以在聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)、甲基丙烯酸明胶(gelma)等常见生物材料中使用，还可以增强含氨基材料的机械性能，避免了小分子爆释，显著降低了细胞毒性，并且在体内和体外都显示出了优异的生物相容性；csnb+gelma生物墨水支持荷载多种细胞的精准打印，打印产物可以进行体外培养，在体内植入过程中也展现出良好的生物相容性和生物降解性。
8.基于光引发聚合的3d生物打印(3d光打印)可以将活细胞构造成功能性的组织甚至器官，是已经一种发展迅速、应用前景广阔的技术。然而，目前的技术还很难兼顾打印分辨率、机械强度和生物相容性，尤其是在打印带细胞水凝胶的场景中。
9.3d光打印的分辨率、机械强度和生物相容性等性能主要由用于3d光打印的生物墨水决定。本发明发现，邻硝基苯衍生物(nb)接枝天然生物大分子构建的大分子物质具有显著提升光成胶分辨率的作用，从而开发了一类新型的生物相容性大分子3d打印墨水添加剂。比如通过将邻硝基苯甲醇衍生物(nb)接枝到硫酸软骨素(cs)上而获得csnb，在常用的生物墨水中添加csnb后，使用紫外光或dlp打印机能够打印出分辨率的3d打印结构。同时csnb还具有高度的生物相容性，并且可以增强含有氨基材料的固化水凝胶的机械强度。
10.为了探寻该大分子生物墨水添加剂提高3d打印的分辨率的机理，本发明经大量研究发现邻硝基苯甲醇衍生物(nb)具有与自由基结合反应的作用。常用的生物墨水通常由光响应基团修饰的天然生物大分子和光引发剂组成，在3d光打印过程中，光照区的光引发剂会产生大量自由基来促使天然生物大分子聚合成凝胶状态，但是光照区产生的自由基容易扩散到非光照区，从而在非光照区也产生自由基聚合反应，使非光照区的部分天然生物大分子也发生了聚合，导致过度固化，严重影响了生物墨水的3d光打印分辨率，使分辨率普遍在100微米以上。nb及其他邻硝基苄醇类物质此前的应用都是利用其可以在光激发下与氨基发生交联的性质来标记蛋白质或产生组织粘附功能，如n-(2-氨基乙基)-4-(4-(羟甲基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酰胺是一种光触发分子，之前有报道称它与-nh2基团交联，并在紫外线照射后帮助水凝胶粘附到组织。本发明经大量研究证明，nb除了与氨基键合之外，还能够通过结合自由基来调控自由基聚合反应。
11.小分子的添加剂很容易透过细胞膜进入细胞，同时打印产物会有小分子爆释，爆释和跨细胞膜扩散可能会对包裹的细胞和附近的细胞产生潜在不良生物学影响。本发明通过将邻硝基苯甲醇衍生物(nb)接枝到天然生物大分子(如硫酸软骨素cs)上，合成了一种大分子的生物墨水添加剂，从而有效避免了小分子能进入细胞并会自打印产物中爆释带来生物学影响，并能充分发挥结合自由基来调控自由基聚合反应的作用，同时大分子添加剂具有较高的空间位阻使nb基团不会短时间内大量向光照区域扩散从而阻止自由基聚合的发
生，从而能够实现曝光位置的精准聚合。本发明提供的大分子生物墨水添加剂(如csnb)是目前发现的第一种能够通过结合自由基来调控自由基聚合反应的高分子添加剂。
12.当然，大分子生物墨水添加剂(如csnb)均匀分布于生物墨水中，因此既能与非光照区的自由基反应，也能与光照区的自由基反应，但由于大分子生物墨水添加剂在生物墨水中的含量少，即使在光照区与少量自由基反应阻止少量自由基的聚合反应，对生物墨水在光照区交联固化的影响也非常小，而且作为大分子，其具有较高的空间位阻，使nb基团不会短时间内大量向光照区域扩散从而阻止自由基聚合的发生，进一步保证了曝光位置的精准聚合；同时大分子生物墨水添加剂(如csnb)在光照下还能与氨基反应来提高机械强度，因此还会更有助于生物墨水在光照区的交联固化。
13.一方面，本发明提供了一种物质用于制备提高3d光打印分辨率的生物墨水添加剂的用途，所述物质为通过将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到天然生物大分子上构建得到的大分子物质。
14.进一步地，本发明所述的邻硝基苯甲醇衍生物如式(1)所示，式(i)中，r1为-h或选自-co(ch2)
x
ch3、-co(ch2ch2o)
x
ch3、-co(ch2)
x
(ch2ch2o)ych3的酯键类、选自-(ch2)
x
ch3、-(ch2ch2o)
x
ch3、-(ch2)
x
(ch2ch2o)ych3的醚键类、选自-coo(ch2)
x
ch3、-coo(ch2ch2o)
x
ch3、-coo(ch2)
x
(ch2ch2o)ych3的碳酸酯键类、选自-conh(ch2)
x
ch3、-conh(ch2ch2o)
x
ch3、-conh(ch2)
x
(ch2ch2o)ych3的异氰酸酯键类，其中x和y≥0且为整数；r2为-h或选自-o(ch2)
x
ch3、-o(ch2ch2o)
x
ch3、-o(ch2)
x
(ch2ch2o)ych3的取代基，其中x和y≥0且为整数；r3选自氨基类连接键-o(ch2)
x
conh(ch2)ynh-、卤代类连接键-o(ch2)
x-和羧基类连接键-o(ch2)
x
co-，其中x和y≥1且为整数；r4为-h或-conh(ch2)
x
ch3，其中x≥0且为整数；p1为生物大分子；
[0015][0016]
进一步地，所述天然生物大分子为硫酸软骨素、透明质酸、明胶、海藻酸钠、丝素、壳聚糖、羧甲基纤维素或胶原中的任意一种。
[0017]
进一步地，所述天然生物大分子为硫酸软骨素，将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到硫酸软骨素上构建得到csnb，csnb在提高3d光打印分辨率的同时，还能提高氨基材料3d光打印产品的机械强度和生物相容性。
[0018]
可以理解，由于nb本身具备与自由基反应从而阻止自由基聚合的作用，因此将nb接枝到任意一种天然大分子上，都能制得提高3d光打印分辨率的生物墨水添加剂，本发明还尝试过用明胶链接的gelnb，以及用透明质酸连接的hanb，发现其都具有类似功能，都能提高3d光打印分辨率，虽然由于不同大分子性质会产生一些其他影响，比如透明质酸较粘稠，容易影响光打印等。
[0019]
硫酸软骨素(cs)是大分子的主要组成部分，是一种多糖，存在于人体的天然软骨和许多其他结缔组织中，但目前所有经修饰的光响应性硫酸软骨素衍生物仅仅报道有用于挤出式打印。
[0020]
本发明考虑到硫酸软骨素(cs)具有很好的生物相容性，价格便宜，更适合用于制
备提高3d光打印分辨率的生物墨水添加剂，而且最开始在使用csnb时意外发现其提高3d光打印分辨率的效果，所以针对csnb进行了大量研究。但事实上，不管nb接枝哪一种大分子物质都能获得提高3d光打印分辨率的效果，都可用于制备生物墨水添加剂，因此也都在本发明的保护范围内。
[0021]
进一步地，所述csnb在提高3d光打印分辨率的同时，还能提高氨基材料3d光打印产品的机械强度和生物相容性。
[0022]
进一步地，所述csnb通过与自由基反应来阻止非光照区域的自由基聚合，从而提高3d光打印分辨率，所述自由基为生物墨水中的光引发剂在光照条件下产生的自由基；所述非光照区域为生物墨水未接收光照的部位。
[0023]
进一步地，所述csnb的结构式如式(2)所示：
[0024][0025]
其中，n＝10～1000。
[0026]
可以理解，任何结构的邻硝基苯甲醇衍生物(nb)接枝到硫酸软骨素(cs)上构建得到的csnb，由于结构都非常相似，同样都具有芳香硝基，都能与自由基反应从而阻止非光照区的自由基聚合，也都能与氨基材料交联来提高机械性能，因此任何结构的邻硝基苯甲醇衍生物(nb)接枝到硫酸软骨素上构建得到的csnb都能用于制备提高3d光打印分辨率的大分子生物墨水添加剂，都能够提高3d光打印分辨率，同时还能提高3d光打印产品的机械强度和生物相容性。
[0027]
在一些方式中，本发明采用的nb为n-(2-氨基乙基)-4-(4-(羟甲基)-2-甲氧基-5-亚硝基苯氧基)丁酰胺(英文名：n-(2-aminoethyl)-4-(4-(hydroxymethyl)-2-methoxy-5-nitrosophenoxy)butanamide)。因此，本发明构建的csnb具有如式(2)所述的具体结构式，但这并不是对csnb具体结构的限制。
[0028]
在一些方式中，csnb是在4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(dmtmm)存在下，通过将羟基邻硝基苄基(nb)共价接枝到硫酸软骨素(cs)上合成的，其中cs链结构单元中的羧基与nb的伯氨基反应，csnb的合成反应式如式(3)所示：
[0029][0030]
[0031]
进一步地，所述生物墨水包括通过光引发自由基聚合的改性生物大分子的和光引发剂。
[0032]
进一步地，所述光引发自由基聚合的改性生物大分子为丙烯酰胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰化明胶、聚乙二醇双丙烯酸酯、甲基丙烯酸化透明质酸或甲基丙烯酸化聚乙烯醇中的任意一种，光引发剂为lap或i2959；所述csnb与生物墨水的质量比为(1～10):100。
[0033]
可以理解的是，采用任何一种通过光引发自由基聚合的改性生物大分子的生物墨水都可以添加本发明提供的这种新型生物大分子csnb，从而起到提高3d光打印分辨率的效果。
[0034]
通过抑制光引发过程中未曝光区域的自由基聚合，csnb可以有效地提高常用生物墨水的光成胶分辨率，如甲基丙烯酸明胶(gelma)和聚乙二醇双丙烯酸酯(pegda)就是较常用的两种用于生物墨水的材料，通过数字光处理(dlp)3d打印或光刻技术都可以制造出精细清晰的结构。
[0035]
同时，与目前用于提高打印分辨率的光吸收剂相比，作为生物大分子csnb不仅能将打印分辨率提高到10μm级别，还可以增强含氨基材料的机械性能，如与纯gelma水凝胶相比，含有csnb的gelma水凝胶的压缩模量提高了4倍。
[0036]
此外，由于避免了小分子光吸收剂的爆释，csnb显著降低了细胞毒性，并且在体内和体外都显示出了优异的生物相容性。研究使用带有多种细胞的gelma/csnb生物墨水打印出了具有复杂结构的产物，并支持打印产物中携带的脂肪源间充质干细胞和hepg2肝细胞在体外培养过程中增殖。
[0037]
再一方面，本发明提供了一种物质用于制备阻止非光照区域的自由基聚合的制剂的用途，所述物质为通过将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到天然生物大分子上构建得到的大分子物质；所述自由基为生物墨水中的光引发剂在光照条件下产生的自由基。
[0038]
进一步地，所述生物墨水包括光响应基团修饰的天然生物大分子和光引发剂；所述非光照区域为生物墨水未接收光照的部位。
[0039]
进一步地，所述csnb通过与自由基反应来阻止非光照区域的自由基聚合，从而能够提高生物墨水的3d光打印分辨率。
[0040]
再一方面，本发明提供了一种物质用于制备能与非光照区的自由基反应的制剂的用途，其所述物质为通过将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到天然生物大分子上构建得到的大分子物质；所述自由基为生物墨水中的光引发剂在光照条件下产生的自由基。
[0041]
进一步地，所述生物墨水包括光响应基团修饰的天然生物大分子和光引发剂；所述非光照区域为生物墨水未接收光照的部位。
[0042]
再一方面，本发明提供了邻硝基苯甲醇衍生物(nb)用于制备与自由基反应从而阻止生物墨水光聚合的制剂的用途。
[0043]
再一方面，本发明提供了邻硝基苯甲醇衍生物(nb)用于制备能与自由基结合的制剂的用途，所述自由基为生物墨水中的光引发剂在光照条件下产生的自由基。
[0044]
再一方面，本发明提供了一种物质用于制备提高3d光打印分辨率的同时，还能提高机械强度和生物相容性的大分子生物墨水添加剂的用途。
[0045]
进一步的，所述物质为通过将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到天然生物大分子上构建得到的大分子物质。
[0046]
进一步的，所述物质为通过将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到硫酸软骨素上构建得到的csnb。
[0047]
本发明提供的可以极大程度增加光打印分辨率的大分子生物墨水添加剂具有以下有益效果：
[0048]
1、发现了nb能与自由基反应的性能，通过将邻硝基苯甲醇衍生物(nb)接枝到天然生物大分子(如硫酸软骨素(cs))上，并添加至生物墨水中，使其与非光照区的自由基反应，有效控制非光照区的自由基聚合，从而有效提高3d光打印分辨率，将打印分辨率提高到10μm级别；
[0049]
2、可以增强含氨基材料的机械性能，如与纯gelma水凝胶相比，含有csnb的gelma水凝胶的压缩模量提高了4倍；
[0050]
3、大分子添加剂，避免了小分子爆释，显著降低了细胞毒性，并且在体内和体外都显示出了优异的生物相容性；
[0051]
4、支持荷载多种细胞的精准打印，打印产物可以进行体外培养，在体内植入过程中也展现出良好的生物相容性和生物降解性。
[0052]
综上，本发明提供新型生物大分子(如csnb)作为一种生物相容的生物光打印添加剂，提供了一种提高3d打印分辨率的便捷方法，并且能增加所打印的含细胞水凝胶的机械性能，该新型生物大分子(如csnb)的应用对组织和器官的重建以及改进的体内仿生研究模型的开发具有重要意义。
附图说明
[0053]
图1为实施例2中的1h-nmr、ft-ir和uv-vis检测cs、nb、csnb、以及cs和nb的混合物的结果示意图；其中a为1h-nmr检测结果图谱；b为ft-ir检测结果图谱；c为uv-vis检测结果示意图；
[0054]
图2为实施例3中pegda和gelma中添加csnb的紫外曝光实验结果图；
[0055]
图3为实施例3中添加不同比例csnb的生物墨水单次曝光实验结果图，其中a为一次曝光的凝胶化系统示意图；b为pegda中添加不同比例csnb的紫外曝光实验结果图；c为gelma中添加不同比例csnb的紫外曝光实验结果图；d为gelma中添加5％cs的紫外曝光实验结果图；
[0056]
图4为实施例3中am、nb和lap经光照后分别通过1h-nmr、epr、lcms/ms检测结果示意图；其中a为1h-nmr检测结果图；b为epr检测结果图；c为lcms/ms检测结果图。
[0057]
图5为实施例3中在gelma中添加的等效的nb和csnb时的效果对比图；
[0058]
图6为实施例3中csnb提高生物墨水3d打印分辨率的机理示意图；
[0059]
图7为实施例4中pegda+csnb生物墨水的ftir红外光谱及5951cm-1
的转化率结果示意图；其中a为pegda+csnb生物墨水在不同光照暴露时间点的ftir光谱；b为pegda+csnb生物墨水在5951cm-1
时的转化率；
[0060]
图8为实施例4中pegda/csnb生物墨水的流变学分析结果图，其中i为纯pegda生物墨水的储能模量和损耗模量；ii为pegda+csnb生物墨水的储能模量和损耗模量；iii为pegda和pegda+csnb的最终储能模量的比较；
[0061]
图9为实施例4中pegda+csnb生物墨水打印提高了打印分辨率的结果示意图，其中
a为dlp 3d打印设置示意图；b为带有荧光珠的3d打印线条的荧光图像(d≈5μm)，比例尺：50μm；c为3d打印微管(i.外径200μm，内径120μm；ii.外径200μm，内径180μm)的cad模型和光学显微镜图像(比例尺：100μm)；d为具有代表性的蝴蝶3d打印结构及其细节，比例尺：ii.500μm；iii.200μm；iv.50μm；e为3d打印埃菲尔铁塔(i.cad模型；ii.纯pegda打印输出；iii.pegda+csnb打印输出；iv.pegda+csnb的3d打印铁塔细节)；
[0062]
图10为实施例4中pegda+csnb生物墨水的打印分辨率和多色打印结果图，通过打印不同宽度的平行线以测试打印分辨率，a为高亮视野显微镜下的3d打印线(设计直径：从左到右分别为60μm、40μm、20μm、10μm，比例尺：200μm)；b为3d打印的心形孔戒指和悉尼歌剧院；c为多色3d打印微管，荧光微球(其中的黑点，d≈5μm)用于模拟细胞，比例尺：100μm；
[0063]
图11为实施例5中采用不同添加剂对gelma3d打印适性和打印产品力学性能的影响研究示意图，其中a为在空气(顶部)和水中(底部)的打印输出，对象的直径为1cm；b为不同的打印产品机械强度的对比；
[0064]
图12为实施例5中gelma+csnb生物墨水打印增强了机械性能，同时提高了打印分辨率的结果示意图，其中a为不同生物墨水的代表性3d打印输出：i.数字模型，ii.gelma，iii.gelma/酚红，iv.gelma/csnb，比例尺：2毫米；b为gelma/csnb生物墨水的流变学分析：i.10％gelma，ii.15％gelma，iii.gelma(10％)/csnb(5％)，时间线从紫外线开启时开始，凝胶点分别为1.905s、3.235s、3.538s，iv.储能模量的比较，蓝色部分代表紫外线照射；c为通过一次紫外线照射制备的水凝胶显示出不同的机械性能；d为代表性压应力-应变曲线；e为使用不同gelma基bioink配方制成的水凝胶的压缩模量；统计显著性通过单因素方差分析和bonferroni的事后检验进行计算。n＝3*p《0.05，***p《0.001，***p《0.0001，数据以平均值
±
标准偏差表示；
[0065]
图13为实施例5中不同gelma生物墨水的流变学分析示意图，其中a、b为应变依赖性；c、d为频率依赖性；a、c为储能模量；b、d为损耗模量；
[0066]
图14为实施例5中线性部分的应力-应变图(在10％应变时切断)；
[0067]
图15为实施例5中不同gelma生物墨水打印产品的力学性能示意图，其中gelma生物墨水分别由10％gelma、15％gelma、10％gelma+5％cs和10％gelma+5％csnb制成水凝胶的压缩弹性模量；
[0068]
图16为实施例5中gelma+csnb水凝胶在紫外线照射前(左)和后(右)的n1s xps光谱；
[0069]
图17为实施例5中gelma/csnb水凝胶的生物相容性结果示意图，其中，a为gelma/csnb水凝胶中包裹的hadsc的活/死染色；b为细胞活力的定量分析，数据以平均值
±
标准差表示，n＝3；c为皮下埋植试验的代表性h&e染色切片；d为gelma/酚红和gelma/csnb 3d打印件的降解曲线，数据以平均值
±
标准差表示，n＝3；e为亮场图像和3d打印hadsc装载微管活/死染色的3d重建，比例尺：在培养10天后，用hepg2(绿色)和huvec(蓝色)打印100μm；f为3d肝脏单位，比例尺：200μm，100μm；
[0070]
图18为实施例5中gelma/csnb生物墨水的体内降解结果示意图，其中a为不同时间点皮下嵌入打印输出的代表性图片；b为不同时间点皮下埋入打印输出和附近皮下组织的代表性h&e染色切片；
[0071]
图19为实施例5中第1天和第7天装载hadsc的3d打印微管的活/死染色分析的显微
镜照片；
[0072]
图20为实施例5中第7天加载hepg2(绿色)和huvec(蓝色)的3d打印肝脏组织结果示意图，其中a为3d重建打印肝脏组织，包括凝胶的自体荧光，以更好地显示材料结构；b、打印肝脏组织的俯视图，比例尺：100μm；
[0073]
图21为实施例6中采用添加gelnb对3d光打印的影响结果对比图，其中左图为采用不含gelnb的生物墨水打印的结果图，右图为采用含有gelnb的生物墨水打印的结果图。
[0074]
图22为实施例7中采用添加hanb进行3d光打印的结果图。
具体实施方式
[0075]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
[0076]
实施例1 nb的合成
[0077]
本实施例提供的nb的合成方法如下：
[0078]
1、合成甲基4-(4-(羟甲基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸酯(mnb)：将4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(8.90g，58.5mmol，1.06eq)、4-溴代丁酸甲酯(9.89g，55.0mmol，1.0eq)和碳酸钾(10.2g，73.8mmol，1.34eq.)溶解在40ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中。将混合物在室温下搅拌过夜，然后倒入200ml冷冻水中沉淀。用水冲洗沉淀物，并在二氯甲烷(dcm)中重新溶解，然后在硫酸镁上干燥。在真空下蒸发溶剂，得到白色粉末(4-(4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基)丁酸甲酯，12.2g，48.4mmol，88％)。
[0079]
将4-(4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基)丁酸甲酯(9.4g，37.3mmol)以非常缓慢的速度添加到140ml硝酸(70％)中，-2℃搅拌3小时。将混合物倒入500ml冷冻水中沉淀，沉淀在dcm中过滤、洗涤、再溶解，并在硫酸镁上干燥。在真空下除去溶剂，得到微黄色固体。将固体溶解在etoh/thf 1:1v/v(100ml)中，并在0℃下缓慢添加硼氢化钠(1.50g，39.7mmol)。3h后，在真空下去除溶剂，并将残余物转移到水/dcm(50ml)1:1v/v(100ml)中。用dcm(2
×
50ml)清洗水层，并在硫酸镁上干燥有机层。在真空下去除溶剂，并将残余物添加到甲醇(100ml)和对甲苯磺酸(50mg)中。溶液在室温下搅拌过夜。在真空下去除溶剂，并将残余物转移到水/dcm(50ml)1:1v/v(100ml)中。用dcm(2
×
50ml)清洗水层，并在硫酸镁上干燥有机层。在真空下去除溶剂，得到黄色固体，通过柱层析进一步纯化(硅胶，己烷/乙酸乙酯＝1:1(rf＝0.6))。最后，获得了mnb(5.22克，4.81mmol，75％)。
[0080]
2、将mnb(0.5g，1.8mmol)和乙二胺(1.1ml，2mmol)溶解在甲醇中，混合物回流。反应完成后，在真空下去除溶剂，残渣在甲醇中重新溶解，并使用乙酸乙酯沉淀三次。然后在真空下干燥沉淀物，得到nb(0.4g，1.2mmol，66.7％)。
[0081]
实施例2 csnb的合成与鉴定
[0082]
2g硫酸软骨素(cs)(南京草本源生物科技有限公司)溶解于100ml mes缓冲液(0.1m，ph＝6.0)中，并在35℃下搅拌直至溶解。然后，在黑暗中持续搅拌，向混合物中添加60mg nb(溶解于10ml二甲基亚砜中)。然后添加1.2g 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化铵(dmtmm)，共加三次，每次间隔半小时。继续反应3小时。通过超滤离
心管(50000截留分子量)和去离子水对产物进行至少5次纯化。最后，csnb在-80℃下冷冻，然后冻干。
[0083]
分别通过核磁共振氢谱(1h-nmr)、傅里叶变换红外光谱(ft-ir)和紫外-可见分光光度法(uv-vis)对制得的csnb进行了检测，检测结果如图1所示，其中a为1h-nmr检测结果图谱，b为ft-ir检测结果图谱，c为uv-vis检测结果示意图。
[0084]
从图1a可以看出，与cs单独相比，nb的特征峰出现在csnb光谱中的δ＝7.75ppm、δ＝7.23ppm和δ＝4.90ppm处，cs+nb时，nb的特征峰依然全部都在，而csnb中，nb的特征峰明显降低，核磁共振氢谱(1h-nmr)证实了csnb的成功合成(图1a)。图1b在1521和1315cm-1
处，通过傅里叶变换红外光谱(ft-ir)确定了nb中的亚硝基苯甲酮峰在csnb中(图1b)。与纯cs、nb或cs和nb的混合物不同，csnb的紫外吸收峰在320至440nm之间，由紫外-可见光谱显示，其与等效nb具有相似但不同的趋势，但显著更低(图1c)。
[0085]
实施例3 pegda和gelma中添加csnb的曝光凝胶化系统实验
[0086]
本实施例首先制备了40％pegda、20％w/v gelma、10％w/v csnb和5％lap的储备溶液。储备溶液通过0.22μm的膜过滤器进行消毒，分别在pegda、pegda/csnb、gelma、gelma/csnb、中加入0.25％光引发剂lap，制备得到四组预水凝胶混合物，分别为纯1、纯pegda；2、pegda/csnb(20％pegda含5％csnb)；3、纯gelma；4、gelma/csnb(10％gelma含6％csnb)，分别将4组预水凝胶混合物倒入圆柱形的pdms模具中，并用带有z、j、e图案的掩模版覆盖，然后将预水凝胶混合物暴露于紫外线(320-500nm，100mw/cm2)下30s，观察形成的水凝胶，以确定它们是否具有与覆盖的照片相同的几何形状。
[0087]
结果如图2所示，在pegda或gelma预水凝胶溶液中添加csnb时，我们发现这种生物墨水比纯pegda或gelma的生物墨水对光路更敏感。通过光照在有照片覆盖的圆柱形pdms模具上时，纯pegda或gelma仅仅能够形成圆柱形水凝胶，而含有csnb的生物墨水则能根据光照区照片的图案形成水凝胶。因此我们令人惊喜地发现，生物墨水中的csnb明显提高了打印分辨率。
[0088]
本实施例进一步还对生物墨水中添加不同浓度的csnb进行实验，分别制备得到四组预水凝胶混合物，分别为1、纯pegda；2、pc2(20％pegda含1％csnb)；3、pc3(20％pegda含3％csnb)、4、pc4(20％pegda含5％csnb)；5、纯gelma；6、gc1(10％gelma含1％csnb)；7、gc3(10％gelma含3％csnb)；8、gc5(10％gelma含4％csnb)；9、gelma+6％cs；分别将9组预水凝胶混合物倒入圆柱形的pdms模具中，并用带有五角星或瓶盖图案的掩模版覆盖，然后将预水凝胶混合物暴露于紫外线(320-500nm，100mw/cm2)下30s，观察形成的水凝胶，以确定它们是否具有与覆盖的照片相同的几何形状。
[0089]
结果如图3的3b和3c可以看出，随着pegda或gelma中csnb浓度的升高，制得的图案化凝胶的分辨率越高，当然csnb浓度也不能无限升高，过高的csnb将有可能影响凝胶的固化。采用本实施例提供的csnb的浓度足以明显提高生物墨水的分辨率。另外由图3的3d可以看出，单在生物墨水中添加cs，不会对生物墨水的分辨率产生任何影响。
[0090]
实施例3 nb作用机理的探索
[0091]
为了研究csnb提高3d光打印分辨率的机制，本实施例设计了一个简化的小分子模型，因为大分子容易在nmr中形成难以识别的重叠峰。广泛使用的生物相容性墨水pegda和gelma均通过不饱和双键通过自由基聚合进行交联。由于丙烯酰胺(am)也含有允许聚合的
不饱和双键，因此在这些分析中使用am进行实验。nb被用作代表csnb的小分子模型，因为cs不影响水凝胶的光分辨率(图3d)。
[0092]
具体步骤为：am、nb和lap(10:1:1)溶解在d2o中，并在紫外线照射前后通过核磁共振氢谱(1h-nmr)进行检测。在紫外光照射前后，用电子顺磁共振(epr)分别对纯lap水溶液和lap/nb(1:1)进行检测。然后通过lcms/ms检测紫外线照射前后对lap/nb(1:1)水溶液的影响。检测结果如图4所示。
[0093]
图4a的下图可以看出，利用核磁共振波谱，在使用丙烯酰胺+锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐(am+lap)系统并且添加nb情况下，uv光照前与uv光照后，am的特征峰b、c的相对强度没有明显变化，表明am在紫外线照射后不会发生聚合。然而，在没有nb的相同条件下，am中双键的特征峰显著减少，am正常聚合。这些核磁共振数据支持nb可以限制自由基引发聚合的假设，因为当uv光照后引发lap产生自由基，没有nb存在下，am在自由基协助下正常聚合，而当nb大量存在时，因nb与自由基先发生反应，从而阻止了am的正常聚合。
[0094]
为了进一步研究其机理，我们进行了电子顺磁共振(epr)来检测系统中自由基的变化。lap的水溶液不含自由基，与我们的预测一致，紫外线照射后可立即检测到自由基(图4b的中间线谱发生明显变化)。然而，当添加nb时，紫外线照射后，epr无法再检测到自由基的产生(图4b)。epr结果表明nb能够捕获体系中的自由基。
[0095]
为了进一步研究反应机理，我们使用lcms/ms研究了am+lap+nb反应体系在紫外光照射下的反应。我们确定了一种组分，其质量电荷比(m/z)为474.22，与图4c所示的预测化学结构完全相同。此外，我们鉴定了一个m/z＝147.08的片段代表lap产生的自由基，另一个m/z＝328.12的片段代表nb。可以推断，nb可以与自由基反应以抑制聚合，并形成中间结构，如图4c所示。
[0096]
综上所述，这些数据表明，csnb中nb基团捕获自由基可提高含csnb生物墨水的分辨率。由于csnb是大分子结构，在空间上是相对受限的，在有图案的uv下会产生自由基浓度差异。只有在紫外线照射区域才会有足够的自由基来支持聚合；一旦游离自由基扩散到邻近区域，它们将被csnb捕获，从而阻止聚合。
[0097]
与小分子nb不同，大分子csnb不能轻易扩散到紫外线暴露区域，因此不会发生添加足够量的nb基团会完全阻止am聚合的现象。
[0098]
另外从图5可以看出，当在gelma中添加的等效的nb和csnb时，csnb的效果明显更好。因此，在含有csnb的生物墨水中，聚合只会发生在uv暴露区域，从而显著提高打印分辨率。
[0099]
因此可以证明，csnb能提高生物墨水3d打印分辨率的机理(图6)，是通过csnb影响光引发的自由基聚合，从而在暴露于图案化光时能够提高打印分辨率。在没有csnb的情况下，自由基可以自由扩散并持续引发聚合。然而，在csnb存在的情况下，自由基被csnb的芳香硝基捕获，导致聚合终止，同时csnb还能与氨基材料交联提高机械强度。因此本发明发现了nb分子调控光引发自由基聚合反应的新作用机理，并将nb接枝至生物大分子硫酸软骨素(cs)上。正常情况下，光照部位产生的自由基会在体系中扩散导致非光照区的聚合；引入csnb后，非光照区域的nb基团可以与扩散的自由基反应，防止光照区域外的反应，同时作为大分子，csnb较高的空间位阻使nb基团不会短时间内大量向光照区域扩散从而阻止自由基聚合的发生，实现曝光位置的精准聚合。
[0100]
实施例4通过常用生物相容性光聚合材料pegda验证csnb的效果
[0101]
作为最常用的3d打印方法之一，dlp可以平衡打印分辨率与规模以及速度，在生物医学领域有着巨大的应用潜力。本实施例选择dlp进行3d打印。
[0102]
本实施例采用的3d打印生物墨水，由20％pegda、4％csnb以及0.25％光引发剂lap组成。将真空干燥的csnb添加到pegda溶液中以制备生物墨水。数字3d模型首先保存为立体光刻(stl)文件，然后沿z轴方向切片为作业文件。将图案逐层投影到目标上。pegda/csnb墨水的紫外线曝光时间为1500ms/层。通过不同的模型确定总打印层数和层厚，层厚在10-100μm之间，层数在1-1000之间。打印产物在预热的pbs缓冲液或培养基(37℃用于细胞装载打印)中冲洗，以去除未固化的墨水。
[0103]
1、添加csnb的pegda生物墨水的特性和可打印性研究
[0104]
pegda是用于生物打印的最广泛使用的基本光聚合墨水之一。然而，纯pegda墨水往往会过度固化，导致胶凝过程失败(如图3b)。本实施例首次对pegda+csnb生物墨水进行研究。对pegda+csnb体系在不同光照时间下进行了ftir分析(将每个样品置于玻璃管中，并配备ftir光谱仪(nicolet is5n，thermo fisher scientific)，通过平均3次重复扫描，在4000至10000cm-1
范围内收集光谱)。检测结果如图7所示，其中图7a为pegda+csnb生物墨水在不同光照暴露时间点的ftir光谱，图7b为pegda+csnb生物墨水在5951cm-1
时的转化率。将光强度设置为相对较低，以更好地展示光固化过程。由图7a看出，聚合速率可以通过在约5951cm-1
处c＝c拉伸力的转换来计算。由图7b可见，聚合在5秒后开始，5951cm-1
时的转化率几乎随光照时间线性增加。
[0105]
pegda/csnb生物墨水的流变学分析结果如图8所示，其中i为纯pegda生物墨水的储能模量和损耗模量；ii为pegda+csnb生物墨水的储能模量和损耗模量；iii为pegda和pegda+csnb的最终储能模量的比较，其中时间线从uv打开时开始(每次测试中uv从50秒开始)，凝胶点(储能模量和损耗模量的交叉点)分别为4.59s和4.29s。
[0106]
由图8可以看出。在使用常用光强度的流变分析中，csnb不会延迟给定配方和条件下的凝胶点，这表明它对dlp打印具有很大的适用性。
[0107]
2、pegda+csnb生物墨水应用于dlp 3d打印
[0108]
然后将pegda+csnb生物墨水应用于dlp 3d打印，图9a为dlp打印的流程示意图。
[0109]
如图10为pegda+csnb生物墨水的打印分辨率和多色打印结果图，通过打印不同宽度的平行线以测试打印分辨率，图10a为高亮视野显微镜下的3d打印线(设计直径：从左到右分别为60μm、40μm、20μm、10μm，比例尺：200μm)，可见分辨率能达到10μm。另外为了避免光学显微镜固有的散焦和荧光染料的扩散(10b)，在生物墨水中使用了直径为5μm的荧光微球，以改善精细打印输出的可视化效果(图9b)，此外，当用于3d打印系统时，微球可用于模拟细胞，以评估潜在的细胞负载3d打印方法和参数。如图9b中从左到右所示，这表明可以实现单细胞分辨率的打印。壁厚分别为40μm和10μm的微管也被打印出来(图9c)。更复杂的图案可以高保真地打印出来，如图9d所示的蝴蝶。此外，该csnb墨水系统可以制作更大的3d物体，如埃菲尔铁塔，同时使用纯pegda，即使模糊的形状也无法打印，而采用pegda+csnb生物墨水却能详细展示埃菲尔铁塔的空心网格(图9e)。其他复杂结构，如带有垂直心形孔的圆环和悉尼歌剧院(图10b)，也成功打印出来，表明改进的z轴分辨率允许生成精细结构。重要的是，还实现了带有多色微球的生物墨水的打印结构，从而可以生成具有三种不同颜色的
复杂图案(图10c)。当使用pegda+csnb生物墨水时，打印速度可达到8.57cm/h，这与最先进的3d打印方法相当，并与流变分析结果一致(图8)。
[0110]
实施例5通过常用生物相容性光聚合材料gelma验证csnb的效果
[0111]
gelma在多种生物医学应用中具有广泛的潜力，因此本实施例研究了csnb是否也能改善gelma水凝胶的性能。研究发现gelma/csnb既提高了打印分辨率，同时增强了生物墨水的机械性能；带有多种细胞的gelma/csnb生物墨水打印出了具有复杂结构的产物，并支持打印产物中携带的脂肪源间充质干细胞和hepg2肝细胞在体外培养过程中增殖。
[0112]
1、gelma+csnb生物墨水提高了打印分辨率，增强了机械性能
[0113]
本实施例采用的3d打印生物墨水，由10％gelma、5％csnb以及0.25％光引发剂lap组成。将真空干燥的csnb添加到gelma溶液中以制备生物墨水。数字3d模型首先保存为立体光刻(stl)文件，然后沿z轴方向切片为作业文件。将图案逐层投影到目标上。gelma/csnb墨水的紫外线曝光时间为5000ms/层。通过不同的模型确定总打印层数和层厚，层厚在10-100μm之间，层数在1-1000之间。打印输出在预热的pbs缓冲液或培养基(37℃用于细胞装载打印)中冲洗，以去除未固化的墨水。
[0114]
实验证明，采用gelma+csnb生物墨水打印，也显示出极大的提高了打印分辨率。如图12a所示，分别采用四种不同的生物墨水配方进行3d打印，其中i为数字模型；ii为纯gelma打印；iii为gelma/酚红打印；iv为gelma/csnb打印，比例尺：2毫米。如图11a，分别采用三种不同的生物墨水配方进行3d打印，从左往右依次为：gelma+csnb、gelma+柠檬黄、gelma+酚红。使用图12a所示的模型模板，纯gelma只能打印为一个大的不规则形状；添加其他光吸收剂，如酚红、柠檬黄，可以打印出整体所需的设计形状，但打印产品界限不清晰且机械强度不够。相比之下，使用gelma+csnb生物墨水却能够打印出具有精细细节的高分辨率结构(图12a、图11a)。
[0115]
经过研究，我们观察到csnb不仅提高了打印分辨率，而且显著提高了成形结构的机械性能。因此我们进一步研究了这种新型生物墨水的物理性质。研究中，除了使用10％的gelma外，还使用15％的gelma作为对照组，因为其固体含量与gelma+csnb生物墨水(10％的gelma+5％的csnb)相同。对这三种生物墨水的流变特性进行了表征(图12b、图13)。凝胶点定义为储能模量(g’)大于损耗模量(g”)的时间。图12b为不同生物墨水的流变学分析结果：其中i.10％gelma，ii.15％gelma，iii.gelma(10％)/csnb(5％)，时间线从紫外线开启时开始，凝胶点分别为1.905s、3.235s、3.538s；iv.储能模量的比较；蓝色部分代表紫外线照射。由图12b可以看出，与具有相同引发剂浓度的15％gelma相比，gelma+csnb生物墨水仅显示出略微延迟的凝胶点(3.235s对3.538s)。打印速度可达3.2cm/h，与当前dlp生物打印方法相当。
[0116]
此外，gelma/csnb生物墨水具有达到凝胶点所需的更高临界能量以及更大的最终储能模量。通常情况下，添加光吸收剂会损害水凝胶的机械性能，但添加csnb时并非如此。如图12c和图11b所示，含有先前报道的添加剂(如酚红或柠檬黄)的gelma固化水凝胶无法支撑其自身重量，而gelma和gelma/csnb水凝胶的硬度足以保持其形状。
[0117]
压缩测试表明，gelma/csnb生物墨水不仅比10％gelma本身或光吸收剂添加剂具有更好的机械性能(显著更高的模量)，也比固体含量相同的15％gelma具有更好的机械性能(图12d和12e，压缩模量是在应力应变在0.05和0.1mm/mm之间的线性区域计算的，图14)。
重要的是，单独添加cs不会导致压缩模量的类似改善，因为刚度低于具有相同固体含量的15％gelma(图15)。这表明，这种现象不仅仅是由大分子或固体含量增加引起的，而是csnb的一种功能。由于nb因其光活性亚胺交联特性而被用作组织粘合剂官能团，硬度的提高可归因于nb和-nh2在gelma中的副反应形成c＝n动态键(图16)。图16为gelma+csnb水凝胶在紫外线照射前(左)和后(右)的n1s xps谱图，由图16可以看出，gelma+csnb水凝胶经紫外照射后，新产生了c＝n键的峰，由此可见，csnb可以判断与gelma的氨基发生交联，从而提高了机械性能。
[0118]
2、csnb+gelma生物墨水的生物相容性研究
[0119]
对于载荷细胞的3d打印，使用每毫升3
×
106个细胞的csnb+gelma生物墨水，打印过程中生物墨水保持在37℃。未标记的脂肪源间充质干细胞用于打印微管；用绿色标记(dio)hepg2肝细胞打印肝组织，人脐静脉内皮细胞(huvec)先经多聚甲醛固定后再用dapi染色成蓝色。打印输出产品用dpbs清洗，并保存在dulbecco改良的eagle培养基中，培养基中含有10％胎牛血清(gibco，10099-141)和1％的p/s，置于细胞培养箱中。
[0120]
3d打印用gelma/csnb生物墨水的物理性能显著改善，也与其本身的高生物相容性相关。我们首先使用人类脂肪来源的间充质干细胞(hadsc)测试了gelma/csnb生物墨水与gelma水凝胶单独相比的细胞相容性。在培养后第1天和第7天对包裹的细胞进行活/死试验，以评估短期和长期生物相容性(图17a)，发现细胞在两个时间点均均匀悬浮在水凝胶中，表明细胞分布不受细胞生长或增殖的影响。定量分析表明，gelma和gelma/csnb水凝胶中的细胞活力相同，计算的活细胞率大于95％，表明gelma和gelma/csnb水凝胶具有较高的细胞相容性(图17b)。
[0121]
除了检测细胞相容性外，本实施例还通过在大鼠皮下植入由gelma/csnb或gelma/酚红制成的3d打印物体来评估体内生物相容性。两组植入水凝胶附近的粒细胞聚集表明，植入后一周出现短期炎症。植入8周后，在组织切片中很难检测到材料，炎症得到解决(图17c、图18)。因此，gelma/csnb水凝胶具有与gelma相似的良好体内生物相容性。此外，打印的gelma/csnb水凝胶的降解速度比gelma/酚红水凝胶慢，这很可能是因为它们的硬度更高(图17d)。
[0122]
接下来，我们使用hadsc对微管进行3d打印，并对打印输出进行活/死分析，从而评估gelma/csnb生物墨水的细胞负载。细胞均匀分布在微管中，几乎看不到死亡细胞(红色信号)，表明dlp打印过程不会损害细胞活力(图17e，图19，adsc的拉长外观是由共焦显微镜的球差引起的，细胞在第1天几乎呈圆形)。培养7天后，微管保持其形状，被包裹的细胞形成网络结构，这表明细胞加载打印输出可以支持细胞生长，并且可以长期培养。为了确定这种方法是否可以用于更复杂的组织打印，我们用huvec打印了肝脏单位的血管结构(轮廓部分)和肝实质结构中的hepg2肝细胞(间隙部分)(图17f)。打印的肝脏单位可在体外培养，10天后打印输出保持其形状，可发现负载的细胞增加(图20)。总之，gelma/csnb生物墨水在体外和体内都具有良好的生物相容性，并且在制造用于各种生物医学应用的具有不同细胞类型的复杂结构方面具有巨大潜力。
[0123]
实施例6 gelnb的合成
[0124]
2g明胶(gel)(默克公司)溶解于100ml mes缓冲液(0.1m，ph＝6.0)中，并在35℃下搅拌直至溶解。然后，在黑暗中持续搅拌，向混合物中添加60mg nb(溶解于10ml二甲基亚砜
中)。然后添加1.2g 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化铵(dmtmm)，共加三次，每次间隔半小时。继续反应3小时。通过超滤离心管(50000截留分子量)和去离子水对产物进行至少5次纯化。最后，csnb在-80℃下冷冻，然后冻干。通过氢核磁共振(1h-nmr)、傅里叶变换红外光谱(ft-ir)和紫外-可见分光光度法(uv-vis)对制得的gelnb进行了检测，证明顺利合成了gelnb。
[0125]
采用由第一组：10％gelma和0.25％光引发剂lap；第二组：10％gelma、5％gelnb以及0.25％光引发剂lap组成的3d打印生物墨水进行3d光打印，打印结果如图21所示，其中左图为采用第一组生物墨水打印，右图为采用第二组生物墨水打印，可见添加gelnb能使打印输出产品的分辨率明显提升，经分析能够实现分辨率达到10μm级别。
[0126]
实施例7 hanb的合成
[0127]
2g透明质酸(ha)(华熙生物)溶解于100ml mes缓冲液(0.1m，ph＝6.0)中，并在35℃下搅拌直至溶解。然后，在黑暗中持续搅拌，向混合物中添加60mg nb(溶解于10ml二甲基亚砜中)。然后添加1.2g 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化铵(dmtmm)，共加三次，每次间隔半小时。继续反应3小时。通过超滤离心管(50000截留分子量)和去离子水对产物进行至少5次纯化。最后，csnb在-80℃下冷冻，然后冻干。通过氢核磁共振(1h-nmr)、傅里叶变换红外光谱(ft-ir)和紫外-可见分光光度法(uv-vis)对制得的hanb进行了检测，证明顺利合成了hanb。
[0128]
采用10％gelma、5％hanb以及0.25％光引发剂lap组成的3d打印生物墨水进行光打印，打印结果如图22所示，由于透明质酸较粘稠，对打印分辨率也稍有影响，但打印分别率也依然能高于未添加时的生物墨水。
[0129]
实施例8讨论分析
[0130]
上述实施例采用含有csnb的生物墨水打印具有不同尺度的精细结构的物体，在不进行后期处理的情况下获得了10μm的分辨率，这也是我们3d打印机的极限分辨率。使用我们目前的设备，复杂图案很容易打印出来。此外，当z轴尺寸增加时，例如在悉尼歌剧院和埃菲尔铁塔结构中，我们仍然实现了清晰、精细的结构细节打印，在打印焦平面和z轴上都呈现出优异的分辨率。而且我们使用csnb打印的埃菲尔铁塔比使用silma打印的铁塔小得多(据报道silma是一种用于高精度打印的生物材料)。此外，csnb的普遍性使其可用于许多生物材料，如gelma。因此，csnb也适合与silma一起使用，以在理论上进一步提高分辨率和机械性能。
[0131]
一般来说，光吸收剂能够提高墨水的打印分辨率，其功能可以部分概括为增加材料完全交联所需的曝光剂量。因此，在许多情况下，最佳打印分辨率的适当曝光剂量不允许材料完全交联，从而导致打印物体的机械性能降低。与以酚红或柠檬黄为光吸收剂的gelma墨水相比，在相同条件下，我们发现gelma/csnb水凝胶的宏观强度更强。流变学分析和压缩试验均表明，csnb显著提高了gelma水凝胶的模量。这一独特的发现主要可以解释为nb上的邻硝基苄基醇在紫外线照射下可与gelma的氨基发生反应。在该体系中，大分子的物理缠结对压缩模量的增加贡献甚微，因为向gelma中添加等量的cs不会导致刚度的增加。因此，当添加csnb时，其他含有伯胺的光交联材料的机械性能也会提高。对于gelma/csnb，固化水凝胶可能包含多网络结构：gelma的交联ma、nb和gelma的-nh2之间的结合，以及可能由gelma与csnb交联产生的网络。如上所述，csnb能够捕获自由基，因此聚合gelma自由基也可以被
csnb捕获，然后形成交联。
[0132]
本实施例4和实施例5都能证明，使用csnb不会显著降低打印速度。与添加添加剂的传统3d打印墨水不同，流变学分析表明，使用含csnb的pegda和gelma墨水的凝胶点没有明显延迟，打印速度(pegda基墨水为8.57cm/h，gelma基墨水为3.2cm/h)。另外，打印速度可以通过增加生物墨水中的双键来提高，就像pegda一样。
[0133]
许多材料已被证明是生物相容性的，gelma是可以支持细胞存活率大于90％的材料之一。由于gelma/csnb水凝胶中的细胞活力没有受损，这表明添加csnb不会损害其他生物相容性材料的细胞相容性，例如与细胞接触较少的生物惰性材料。体内试验还表明，csnb不会加剧炎症，当添加到可降解材料时，水凝胶可以完全降解。因此可以推断，在生物墨水中引入csnb不会影响其在生物医学应用中的使用。
[0134]
载细胞3d打印以高清分辨率和高细胞活性，可以更好地满足临床需求，如不规则缺陷或微血管。重要的是，细胞在打印输出中分布均匀，可以在培养基中保持数天。打印输出的细胞可以伸展、生长并逐渐填充材料，因此，预计水凝胶降解后，打印输出的细胞将形成新的组织。加载不同类型的粒子或细胞来打印复杂结构已经在我们的系统中进行了测试。载细胞3d打印可以更有效地制作模拟组织和研究细胞基质或细胞间相互作用的体外模型，例如肝脏组织。此外，该系统可用于创建分隔的微流控平台，并通过在精细结构中装载不同的颗粒，可提供改进的控释系统或区域引导的细胞分化，如用于各种平台，包括神经科学。
[0135]
综上所述，本发明开发了一种用于uv固化3d打印生物墨水的新型多功能生物大分子添加剂(如csnb和gelnb)。该添加剂可以显著提高打印分辨率，简化打印参数的优化，还可以增加水凝胶的刚度，避免小分子突然释放造成的潜在毒性。重要的是，如gelma/csnb生物墨水在体外和体内都显示出高度的生物相容性，并且它可以产生长期和高细胞活力的多细胞3d打印输出。使用csnb可以更容易地生成具有精确结构的复杂3d打印输出。高度生物相容性添加剂csnb通过快速生成定制设计的仿生3d结构来研究细胞行为，并通过改善结构相似性促进组织重建，为体外和体内应用提供了一个新的平台。csnb的研究为开发新的生物大分子和设计新的3d生物墨水配方提供了全新的见解。
[0136]
本发明未尽事宜为公知技术。虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

技术特征：
1.一种物质用于制备提高3d光打印分辨率的生物墨水添加剂的用途，其特征在于，所述物质为通过将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到天然生物大分子上构建得到的大分子物质。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述天然生物大分子为硫酸软骨素、透明质酸、明胶、海藻酸钠、丝素、壳聚糖、羧甲基纤维素或胶原中的任意一种；所述的邻硝基苯甲醇衍生物如式(1)所示，其中，r1为-h或选自-co(ch2)
x
ch3、-co(ch2ch2o)
x
ch3、-co(ch2)
x
(ch2ch2o)
y
ch3的酯键类、选自-(ch2)
x
ch3、-(ch2ch2o)
x
ch3、-(ch2)
x
(ch2ch2o)
y
ch3、的醚键类、选自-coo(ch2)
x
ch3、-coo(ch2ch2o)
x
ch3、-coo(ch2)
x
(ch2ch2o)
y
ch3的碳酸酯键类、选自-conh(ch2)
x
ch3、-conh(ch2ch2o)
x
ch3、-conh(ch2)
x
(ch2ch2o)
y
ch3的异氰酸酯键类，其中x和y≥0且为整数；r2为-h或选自-o(ch2)
x
ch3、-o(ch2ch2o)
x
ch3、-o(ch2)
x
(ch2ch2o)
y
ch3的取代基，其中x和y≥0且为整数；r3选自氨基类连接键-o(ch2)
x
conh(ch2)
y
nh-、卤代类连接键-o(ch2)
x-和羧基类连接键-o(ch2)
x
co-，其中x和y≥1且为整数；r4为-h或-conh(ch2)
x
ch3，其中x≥0且为整数；p1为生物大分子。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述天然生物大分子为硫酸软骨素，将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到硫酸软骨素上构建得到csnb，csnb在提高3d光打印分辨率的同时，还能提高3d光打印产品的机械强度和生物相容性。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述csnb通过与自由基反应来阻止非光照区域的自由基聚合，从而提高3d光打印分辨率，所述自由基为生物墨水中的光引发剂在光照条件下产生的自由基；所述非光照区域为生物墨水未接收光照的部位。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述csnb的结构式如式(2)所示：其中，n＝10～1000。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述生物墨水包括光引发自由基聚合的分子和光引发剂。7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述光引发自由基聚合的分子为丙烯酰胺、
甲基丙烯酸、甲基丙烯酰化明胶、聚乙二醇双丙烯酸酯、甲基丙烯酸化透明质酸或甲基丙烯酸化聚乙烯醇中的任意一种，光引发剂为lap或i2959；所述csnb与生物墨水的质量比为(1～10):100。8.一种物质用于制备阻止非光照区域的自由基聚合的制剂的用途，其特征在于，所述物质为通过将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到天然生物大分子上构建得到的大分子物质；所述自由基为生物墨水中的光引发剂在光照条件下产生的自由基。9.一种物质用于制备能与非光照区的自由基反应的制剂的用途，其特征在于，所述物质为通过将邻硝基苯甲醇衍生物接枝到天然生物大分子上构建得到的大分子物质；所述自由基为生物墨水中的光引发剂在光照条件下产生的自由基。10.邻硝基苯甲醇衍生物用于制备能与自由基结合的制剂的用途，所述自由基为生物墨水中的光引发剂在光照条件下产生的自由基。

技术总结
本发明提供了一种提高3D光打印分辨率的生物墨水添加剂及其应用，通过将邻硝基苯甲醇衍生物(NB)接枝到天然生物大分子（如硫酸软骨素(CS)）上，合成了一种新型生物墨水添加剂，其能通过抑制光引发过程中未曝光区域的自由基聚合，将打印分辨率提高到10μm级别，可以在常见生物材料中使用，还可以增强含氨基材料的机械性能，避免了小分子爆释，显著降低了细胞毒性，并且在体内和体外都显示出了优异的生物相容性。容性。容性。


技术研发人员：欧阳宏伟 马远瞩 魏威
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.03.24
技术公布日：2023/10/8