生物影像探针单元、生物影像纳米探针及制备方法与应用

1.本发明属于医学影像技术领域，具体涉及一种生物影像探针单元、生物影像纳米探针及制备方法与应用。


背景技术：

2.干细胞再生医疗是一个新兴的生物医学领域，其基本思路是通过诱导移植体内的干细胞定向分化为功能细胞，实现对受损组织和器官的再生修复。在干细胞再生医疗过程中，实时跟踪干细胞移植体内后的存活、迁移和归巢、定向分化等属性演变过程，从而深入认识干细胞在体内的迁移、繁殖、分裂与分化等生理过程，对于干细胞生物学基础研究，及在临床上的疗效观察和功能恢复评估，都具有非常重要的意义。
3.可用于动态示踪干细胞体内属性演变过程的活体影像技术主要包括磁共振影像(mri)、正电子发射断层扫描(pet)、x-射线或同步辐射计算机断层扫描(ct)、单光子发射计算机断层扫描(spect)、及各种光学成像技术。这些技术在用于动态示踪干细胞体内属性演变过程时各有所长及局限性。mri的优点是空间分辨率高、无电离辐射、对比度好、适合软组织成像、不受组织深度限制、标记及成像方法灵活多变，但也存在成像时间长、灵敏度低的局限性；ct的主要特点是时间分辨率显著提高，还可以获得比mri更高的空间分辨率，局限性是有电离辐射，不适合软组织成像；pet和spect都是通过γ粒子的检测成像，优点是时间分辨率高、对比度好、适合软组织成像、不受组织深度限制，灵敏度优于mri和ct但低于荧光影像技术，其中pet存在电离辐射、需要放射性标记且标记物半衰期短；荧光成像技术通常具有很高的灵敏度和信噪比，但是成像空间分辨率和组织深度限制是其面临的两个主要挑战。另外，mri及ct的临床普及率高，pet次之，荧光影像技术的临床普及率较低。目前，细胞移植活体影像技术研究应用比较深入的是mri、pet和各种荧光影像技术，mri被认为是该领域最有前景的技术。
4.这些影像技术用于细胞活体示踪时，都需要通过造影剂标记将移植干细胞与体内组织区分开来。早在1990s年代，很多研究机构就开始了mri活体影像示踪细胞移植的研究，细胞标记大部分采用基于超顺磁氧化铁纳米粒子(spio：super-paramagnetic iron oxide)的t2型商业造影剂，如feridex、resovist、sinerum等，以及为克服商业造影剂的局限性研究的各种特殊结构的spio纳米造影剂。例如，将spio纳米粒子嵌入到微米级聚合物微球以降低其体内降解速度，用于干细胞标记获得了单细胞影像灵敏度。t1型造影剂gd基络合物用于干细胞标记也得到了广泛的研究，通常是组装成脂质体纳米粒子或与线状或树枝状大分子偶联。
5.stanford大学医学院2012年采用了一种间接方法报告移植细胞死亡：将spio造影剂通过静脉注射到小鼠体内，小鼠体内的巨噬细胞摄取血液中的spio造影剂；48小时后将活干细胞和诱导凋亡干细胞分别移植到小鼠右股骨和左股骨关节。实验发现，作为对死亡细胞的免疫反应，摄取了spio造影剂的巨噬细胞在死亡细胞所处区域富集，导致移植凋亡细胞的左股骨关节部位两周后产生mri暗信号，从而可以间接获得移植细胞死亡的信息，但
是这个方法呈现的影像对比度差异不够显著。
6.2015年，他们又基于细胞凋亡过程中表达更多的caspase-3，设计了一种能被caspase-3切割的gd基造影剂，后者在凋亡细胞位置被caspase-3切割后再自组装成纳米粒子并诱导产生mri亮信号增强，从而报告细胞凋亡，这个方法呈现的影像对比度差异也不够显著。
7.johns hopkins大学医学院2015年报道了通过spio+dtpa双标记细胞，细胞移植体内后，死亡细胞释放的dtpa扩散速度比spio快，从而在呈现mri暗信号的移植细胞外围诱导产生一个亮信号区域，也可以提供细胞死亡的信息。但由于移植细胞在存活过程中也会通过胞吐过程释放小分子物质如dtpa，因此这个策略报告细胞死亡的假设前提并不能成立。
8.专利cn201510946966.9公开了一种使用物理方法诱导细胞自组装成纳米粒子，形成的纳米粒子使标记的细胞呈现mri信号减弱效应，可以用于报告移植细胞的迁移和死亡过程。
9.总的来说，mri活体影像技术动态示踪干细胞体内属性演变的技术绝大部分局限在提供细胞的迁移和归巢的信息，只有少数几项技术触及干细胞在体内的存活状态，迄今没有见到能提供干细胞定向分化过程及分化结果信息的技术，后者对于揭示干细胞体内属性演变的调控机制、再生修复障碍的发生机制等至关重要，因此是这个研究领域目前急需的技术。


技术实现要素：

10.本发明的主要目的在于提供一种生物影像探针单元、生物影像纳米探针及制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
11.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
12.本发明实施例提供了一种生物影像探针单元的制备方法，其包括：
13.通过点击化学反应将活性基团a接枝于环糊精分子表面；其中，所述活性基团a包括烯基和/或炔基；
14.将影像探针分子与活性基团b偶联，之后使活性基团b与接枝于环糊精分子表面的活性基团a进行点击化学反应，从而将影像探针分子接枝于环糊精分子表面，制得生物影像探针单元；其中，所述活性基团b包括巯基官能团。
15.本发明实施例还提供了前述的制备方法制得的生物影像探针单元。
16.本发明实施例还提供了一种生物影像纳米探针的制备方法，其包括：
17.采用前述的制备方法制备生物影像探针单元；
18.采用前述的方法制备生物影像探针单元，之后将活性基团c置入所述生物影像探针单元中的环糊精分子内腔，然后使活性基团c与活性基团d进行点击化学反应，以将至少两个所述生物影像探针单元相互连接，从而制得生物影像纳米探针；
19.其中，所述活性基团c具有至少两个第一活性位点，所述活性基团d具有至少两个第二活性位点，每一第一活性位点能与相应一第二活性位点进行点击化学反应。
20.本发明实施例还提供了前述的制备方法制得的生物影像纳米探针。
21.本发明实施例还提供了前述的生物影像探针单元或生物影像纳米探针在活体细胞示踪领域中的用途。
22.本发明实施例还提供了一种实时监测细胞分化的方法，其包括：
23.提供前述的生物影像纳米探针；
24.以所述生物影像纳米探针标记细胞，之后将经过标记的细胞诱导分化为目标子代细胞，所述诱导分化过程中产生的特异性酶能够催化切割所述生物影像纳米探针中的酶底物，之后通过磁共振成像系统或者荧光成像系统进行监测，从而实现对细胞分化的过程或结果的实时监测。
25.本发明实施例还提供了一种生物成像方法，所述方法是非医学诊疗目的的，其包括：
26.以前述的生物影像纳米探针标记细胞，之后将经过标记的细胞移植到生物体内，然后通过磁共振成像系统或者荧光成像系统实现生物成像。
27.本发明实施例还提供了一种产品，应用于实时监测细胞属性变化，所述产品包括前述的生物影像纳米探针。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
29.(1)本发明中的生物影像纳米探针可以用于报告组织和细胞中特定酶的活性，从而可以用于报告细胞的特定生理过程，包括但不限于细胞分化等生理过程；
30.(2)本发明中的生物影像纳米探针构建方法简便，环糊精分子外表面接枝探针分子及其后续的纳米组装都是通过高效的点击化学反应进行；
31.(3)本发明中的生物影像纳米探针是纳米探针通过共价键组装，可以有效避免分子间作用力组装体伴随的单体小分子信号的干扰，这个特征对利用本发明所述的磁共振影像方法报告细胞生理过程至关重要；
32.(4)本发明中的生物影像纳米探针具有较好的通用性，通过更换酶底物，可以得到报告不同酶生理活性的纳米探针，具有广泛的用途。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1为本发明一典型实施方案中提供的生物影像纳米探针的结构和构建方法示意图；
35.图2为本发明实施例1提供的β-cd接枝马来酸、再偶联马来酰亚胺过程中的中间体和产物1h nmr谱；
36.图3为本发明实施例2提供的β-cd分子内腔嵌入1，4-二马来酰亚胺基苯(活性基团c)及其与半胱氨酸甲酯(活性基团d)点击反应1h nmr谱；
37.图4为本发明实施例3提供的酶响应β-cd荧光纳米探针合成过程中的中间体和产物荧光谱；
38.图5为本发明实施例4提供的酶响应β-cd荧光纳米探针报告细胞分化过程的荧光影像图；
39.图6为本发明实施例5提供的β-cd分子内腔嵌入1，3-二马来酰亚胺基丙烷(活性基
团c)及其与半胱氨酸甲酯(活性基团d)点击反应1h nmr谱；
40.图7为本发明实施例6提供的酶响应β-cd分子磁共振影像纳米探针报告细胞分化过程的mri影像图。
具体实施方式
41.鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种生物影像探针单元的制备方法包括：
43.通过点击化学反应将活性基团a接枝于环糊精分子表面；其中，所述活性基团a包括烯基和/或炔基；
44.将影像探针分子与活性基团b偶联，之后使活性基团b与接枝于环糊精分子表面的活性基团a进行点击化学反应，从而将影像探针分子接枝于环糊精分子表面，制得生物影像探针单元；其中，所述活性基团b包括巯基官能团。
45.在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：将影像探针分子通过第一酶底物与活性基团b偶联，之后使活性基团b与接枝于环糊精分子表面的活性基团a进行点击化学反应，从而制得酶响应的生物影像探针单元。
46.在一些优选实施方案中，所述环糊精包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精中的任意一种或多种的组合，且不限于此。
47.进一步地，所述环糊精为β-环糊精。
48.在一些优选实施方案中，所述活性基团a的来源包括含烯基和/或炔基官能团的化合物，且不限于此。
49.在一些优选实施方案中，所述活性基团b的来源包括硫醇和/或半胱氨酸，且不限于此。
50.在一些优选实施方案中，所述第一酶底物包括多肽底物，且不限于此。
51.进一步地，所述多肽底物包括含有frfk结构的多肽和/或含有devd结构的多肽，且不限于此。
52.在一些优选实施方案中，所述影像探针分子包括磁共振影像探针分子和/或荧光影像探针分子，且不限于此。
53.进一步地，所述磁共振影像探针分子包括gd基络合物探针。
54.进一步地，所述荧光影像探针分子包括分子内淬灭荧光探针。
55.进一步地，当接上gd基络合物探针时，就可以用来mri成像；当接枝上含有分子内猝灭基团时，就可以通过酶切来做荧光成像。
56.在一些优选实施方案中，所述制备方法还包括：使溴丙烯在碱催化下通过成醚反应接枝丙烯，获得含所述活性基团a的化合物。
57.在一些优选实施方案中，所述制备方法还包括：使溴丙基马来酰亚胺在碱催化下通过成醚反应接枝马来酰亚胺，获得含所述活性基团a的化合物。
58.在一些优选实施方案中，所述制备方法还包括：使马来酸酐在碱催化下通过成酯反应接枝马来酸，获得含所述活性基团a的化合物。
59.在一些优选实施方案中，所述制备方法还包括：使马来酸酐在碱催化下通过成酯反应接枝马来酸，再与氨基马来酰亚胺反应，并通过生成酰胺键接枝马来酰亚胺，获得含所述活性基团a的化合物。
60.在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：使环糊精与含所述活性基团a的化合物发生接枝反应，从而获得表面接枝有所述活性基团a的环糊精。
61.在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：在第一酶底物的两端分别偶联磁共振影像探针分子和活性基团b，之后与表面接枝有所述活性基团a的环糊精反应，获得生物影像探针单元。
62.进一步地，所述磁共振影像探针分子包括磁共振造影单元，所述磁共振造影单元包括超顺磁金属络合物，所述超顺磁金属络合物由超顺磁金属和络合剂组成。
63.更近一步地，所述超顺磁金属是具有超顺磁特性的金属，包括但不限于镧系金属镨(pr)，钕(nd)，钷(pm)，钐(sm)，铕(eu)，钆(gd)，铽(tb)，镝(dy)，钬(ho)，铒(er)，铥(tm)，镱(yb)，镥(lu)，及非镧系金属铬(cr)，锰(mn)，铁(fe)，钴(co)，镍(ni)，铜(cu)，钇(y)，铌(nb)等。
64.更近一步地，所述超顺磁金属络合物的络合剂选自dota，hp-do3a，do3a-butrol，dtpa-bma，dtpa，dtpa-bmea，bopta，eob-dtpa或其衍生物及其任意组合，且不限于此。
65.在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：在第一酶底物的两端分别偶联荧光影像探针分子和活性基团b，之与表面接枝有活性基团a的环糊精反应，从而获得生物影像探针单元。
66.进一步地，所述荧光影像探针分子包括邻氨基苯甲酰，且不限于此。
67.进一步地，所述制备方法还包括：将荧光淬灭基团通过第一酶底物与所述荧光影像探针分子连接；其中，所述荧光淬灭基团包括2，4-二硝基苯撑，且不限于此。
68.进一步地，将一个具有荧光淬灭功能的活性基团c嵌入环糊精的内腔，所述具有荧光淬灭功能的活性基团c包括但不限于1，3-二马来酰亚胺基丙烷、1，4-二马来酰亚胺基苯等。
69.本发明实施例的另一个方面还提供了前述的制备方法制得的生物影像探针单元。
70.本发明实施例的另一个方面还提供了一种生物影像纳米探针的制备方法，其包括：
71.采用前述的方法制备生物影像探针单元，之后将活性基团c置入所述生物影像探针单元中的环糊精分子内腔，然后使活性基团c与活性基团d进行点击化学反应，以将至少两个所述生物影像探针单元相互连接，从而制得生物影像纳米探针；
72.其中，所述活性基团c具有至少两个第一活性位点，所述活性基团d具有至少两个第二活性位点，每一第一活性位点能与相应一第二活性位点进行点击化学反应。
73.在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：在第二酶底物上偶联至少两个活性基团d，然后使所述活性基团d与嵌入所述环糊精分子内腔的活性基团c进行点击化学反应，以将至少两个所述生物影像探针单元相互连接，从而制得酶响应的生物影像纳米探针。
74.在一些优选实施方案中，所述活性基团c的来源包括烷基、芳香环或芳香杂环偶联的烯烃和/或烷基、芳香环或芳香杂环偶联的炔烃。
75.进一步地，所述活性基团c的来源包括偶联双炔基化合物、双马来酰亚胺化合物、双丙烯酸酯化合物中的任意一种或多种的组合，且不限于此。
76.进一步地，所述活性基团c的来源包括对二乙炔苯、4，4
′‑
二乙炔联苯、1，3-二马来酰亚胺基丙烷、1，4-二马来酰亚胺基苯、1，4-二丙烯酸亚苯酯、4，4
′‑
二丙烯酸联苯酯中的任意一种或多种的组合，且不限于此。
77.进一步地，所述第二酶底物包括两端含有两个半胱氨酸的多肽片段；例如：cfrfk(c)或者cdevdk(c)其中一端c接在k的侧链基团上，可以长多肽的长度，且c端的巯基可以更好地裸漏出来，降低和烯烃或者炔烃反应的位阻，增大反应效率。
78.在一些优选实施方案中，所述活性基团d的来源包括含两个以上硫醇和/或半胱氨酸的有机化合物
79.在一些更为具体的实施方案中，所述生物影像纳米探针的制备方法包括：
80.(a)利用环糊精分子外表面的羟基接枝点击化学反应活性基团a；
81.所述环糊精可以是α-环糊精，β-环糊精，或γ-环糊精，优选β-环糊精；
82.所述活性基团a包括但不限于各种有机分子的烯烃、炔烃官能团；
83.(b)将影像探针分子偶联点击化学反应活性基团b，再与活性基团a通过点击化学反应接枝到环糊精外表面；
84.所述活性基团b包括但不限于能与烯烃或炔烃官能团发生点击化学反应的巯基官能团，如硫醇、半胱氨酸等；
85.通过步骤(a)和(b)构建一个探针基本单元，即前述的生物影像探针单元；
86.特别地，所述探针分子通过酶底物偶联活性基团b，通过步骤(a)和(b)构建一个能被目标酶可控激活的探针基本单元；
87.(c)利用环糊精分子疏水内腔的包覆功能，将合适的点击化学反应活性基团c嵌入环糊精的内腔；
88.所述活性基团c包括但不限于烷基、芳香环或芳香杂环偶联烯烃或炔烃官能团的有机化合物，如偶联双炔基、双马来酰亚胺、双丙烯酸酯的有机化合物；
89.(d)利用活性基团d与活性基团c的点击化学反应，将探针基本单元通过共价键进一步组装成生物影像纳米探针；
90.所述活性基团d包括但不限于能与烯烃或炔烃官能团发生点击化学反应的巯基官能团，如含两个或两个以上硫醇和/或半胱氨酸的有机化合物；
91.通过步骤(c)和(d)构建一个生物影像纳米探针；
92.特别地，所述活性基团d偶联到酶底物的两端，通过步骤c和d构建一个酶响应生物影像纳米探针，使得组装得到的纳米探针可以被目标酶可控催化降解为探针基本单元；
93.所述生物影像纳米探针包括但不限于磁共振影像探针、荧光影像探针等；
94.所述磁共振影像探针包括但不限于gd基络合物探针；
95.所述荧光影像探针包括但不限于分子内淬灭荧光探针；
96.所述生物影像纳米探针通过针对不同的目标酶更换所述的酶底物，可以得到报告不同酶生理活性的纳米探针，从而获得细胞不同生理过程的信息，包括但不限于细胞定向
分化的信息等。
97.本发明中生物影像纳米探针的构建方法示意图如图1所示，所述生物影像纳米探针的粒径为200nm-600nm。
98.在一些优选实施方案中，本发明通过环糊精分子外表面接枝上的点击化学反应活性官能团a的个数需要足够多，以保证后续偶联的磁共振探针分子的个数足够多，这对于后续构建酶响应的生物影像纳米探针标记细胞后，保证标记细胞在t2加权mri模式下呈现暗信号至关重要。
99.在一些优选实施方案中，所述生物影像纳米探针由β-cd(β-环糊精)接枝不少于7个马来酸，马来酸引入的烯烃官能团总数不少于7个，作为点击化学反应活性基团a。
100.在一些优选实施方案中，所述生物影像纳米探针由β-cd接枝马来酸后，再偶联马来酰亚胺构成；每个β-cd分子表面接枝的马来酸不少于6个，所述偶联的马来酰亚胺不少于3个，马来酸和马来酰亚胺引入的烯烃官能团总数不少于9个，作为点击化学反应活性基团a。
101.在一些优选实施方案中，所述生物影像纳米探针由β-cd分子内腔嵌入1，4-二马来酰亚胺基苯作为活性基团c，再与半胱氨酸甲酯(活性基团d)发生点击反应，以确认通过共价键组装纳米探针的化学可行性。
102.在一些优选实施方案中，本发明提供了β-cd分子表面接枝马来酸和马来酰亚胺过程中，中间体和终产物的1hnmr谱以资佐证，如图2所示。
103.在一些优选实施方案中，本发明提供了一个β-cd分子内腔嵌入1，4-二马来酰亚胺基苯作为活性基团c，再与半胱氨酸甲酯(活性基团d)发生点击反应过程中，中间体和终产物的1hnmr谱以资佐证，如图3所示。
104.在一些优选实施方案中，所述生物影像纳米探针为荧光生物影像纳米探针时，所述荧光生物影像纳米探针首先在β-cd分子表面接枝马来酸和马来酰亚胺作为活性基团a，再将偶联了荧光基团abz的半胱氨酸(活性基团b)通过点击化学反应接枝到β-cd表面；然后在β-cd分子内腔嵌入1，4-二马来酰亚胺基苯作为活性基团c，再与半胱氨酸甲酯(活性基团d)发生点击反应，通过测量构建过程中每个步骤产物荧光强度的变化，进一步确认通过共价键组装纳米探针的可行性。
105.在一些优选实施方案中，本发明提供了一个β-cd分子表面接枝荧光基团abz后，分子内腔嵌入1，4-二马来酰亚胺基苯作为活性基团c，再与半胱氨酸甲酯(活性基团d)发生点击反应过程中，每个构建步骤产物的荧光强度以资佐证，如图4所示。
106.在一些优选实施方案中，本发明中的生物影像纳米探针首先在β-cd分子表面接枝马来酸和马来酰亚胺作为活性基团a，再将偶联了荧光基团abz的半胱氨酸(活性基团b)通过点击化学反应接枝到β-cd表面；然后在β-cd分子内腔嵌入1，4-二马来酰亚胺基苯作为活性基团c，再在组织蛋白酶b的多肽底物frfk两端连接半胱氨酸作为活性基团d(cfrfk(c))，通过与活性基团c的点击化学反应，组装成酶响应荧光影像纳米探针。
107.在一些优选实施方案中，本发明将生物影像纳米探针标记hl60细胞，诱导细胞分化为巨噬细胞或中心粒细胞过程中，通过细胞荧光强度的变化差异提供细胞分化过程和结果的信息，如图5所示。
108.在一些优选实施方案中，本发明提供了生物影像纳米探针构建方案的验证方法。
首先在β-cd分子表面接枝马来酸和马来酰亚胺作为活性基团a，再将磁共振探针络合剂dota和作为活性基团b的半胱氨酸偶联到组织蛋白酶b的多肽底物frfk两端(cfrfk(k)-(dota)2)，通过活性基团b与活性基团a的点击化学反应接枝到β-cd表面；然后在β-cd分子内腔嵌入1，3-二马来酰亚胺基丙烷作为活性基团c，再与半胱氨酸甲酯(活性基团d)发生点击化学反应，以确认通过共价键组装酶响应磁共振影像纳米探针的化学可行性。
109.在一些优选实施方案中，本发明提供了β-cd分子表面接枝马来酸和马来酰亚胺后再接枝磁共振探针络合剂、内腔再嵌入1，3-二马来酰亚胺基丙烷及其与半胱氨酸甲酯发生点击化学反应过程中，中间体和终产物的1h nmr谱以资佐证，如图6所示。
110.在一些优选实施方案中，本发明提供一种β-cd接枝组装的酶响应磁共振影像纳米探针。所述β-cd接枝组装的酶响应磁共振影像纳米探针，首先在β-cd分子表面接枝马来酸和马来酰亚胺作为活性基团a，再将磁共振探针络合剂gd-dota和作为活性基团b的半胱氨酸偶联到组织蛋白酶b的多肽底物frfk两端(cfrfk(k)-(dota-gd)2)，通过活性基团b与活性基团a的点击化学反应接枝到β-cd表面；然后在β-cd分子内腔嵌入1，4-二马来酰亚胺基苯作为活性基团c，再在组织蛋白酶b的多肽底物frfk两端连接半胱氨酸作为活性基团d(cfrfk(c))，通过与活性基团c的点击化学反应，组装成酶响应磁共振影像纳米探针。
111.在一些优选实施方案中，本发明提供了生物影像纳米探针的构建方法及其用于标记hl60细胞，并将细胞移植到小鼠体内，再诱导细胞分化为巨噬细胞过程中，利用活体mri观察移植细胞及其周边组织mri对比度的差异，以获得移植细胞在体内分化过程和结果的影像学信息，如图7所示。
112.本发明实施例的另一个方面还提供了前述的制备方法制得的生物影像纳米探针。
113.在一些优选实施方案中，所述生物影像纳米探针包括磁共振生物影像纳米探针和/或荧光生物影像纳米探针，且不限于此。
114.具体地，本发明是首先利用环糊精分子外侧表面的羟基接枝各种点击化学反应活性基团a，再将探针分子偶联活性基团b后通过点击化学反应接枝到环糊精外表面；特别地，探针分子通过酶底物偶联活性基团b，构成一个能被目标酶可控激活的探针基本单元；然后又利用环糊精分子疏水内腔的包覆功能，将合适的点击化学反应活性基团c嵌入环糊精的内腔，再利用活性基团d通过点击化学反应将探针基本单元进一步组装成纳米探针(纳米线或纳米粒子)；特别地，参与点击化学反应的活性基团d与酶底物偶联，使得组装得到的纳米探针也可以被目标酶可控催化降解为探针基本单元。所述生物影像探针包括但不限于磁共振影像探针、荧光影像探针等；所述磁共振影像探针包括但不限于gd基络合物探针；所述荧光影像探针包括但不限于分子内淬灭荧光探针。
115.本发明实施例的另一个方面还提供了前述的生物影像探针单元或生物影像纳米探针在活体细胞示踪领域中的用途。
116.本发明实施例的另一个方面还提供了一种实时监测细胞属性变化的方法，其包括：
117.提供前述的生物影像纳米探针；
118.以所述生物影像纳米探针标记细胞，之后将经过标记的细胞诱导分化为目标子代细胞，所述诱导分化过程中产生的特异性酶能够催化切割所述生物影像纳米探针中的酶底物，之后通过磁共振成像系统或者荧光成像系统进行监测，从而实现对细胞分化的过程或
结果的实时监测。
119.在一些优选实施方案中，所述细胞包括hl60细胞和/或hmscs，且不限于此。
120.在一些优选实施方案中，所述特异性酶包括catb酶和/或caspase 3酶，且不限于此。
121.在一些优选实施方案中，所述生物影像纳米探针为荧光生物影像纳米探针时，所述实时监测细胞分化的方法包括：
122.将所述荧光生物影像纳米探针经体外标记进入细胞，获得标记细胞；
123.将所述标记细胞诱导分化为目标子代细胞；
124.所述标记细胞分化为目标子代细胞过程中过表达所述特异性酶；
125.所述特异性酶催化切割酶底物，导致所述淬灭接团脱离纳米探针；遗留在荧光纳米探针上的荧光基团发出荧光被荧光成像仪检测到，从而报告细胞分化的过程或结果；
126.或者所述特异性酶催化切割酶底物，所述荧光影像纳米探针降解为探针基本单元并从细胞逸出，导致标记细胞的荧光强度衰减，从而报告细胞分化的过程或结果。
127.在一些优选实施方案中，所述生物影像纳米探针为磁共振生物影像纳米探针时，所述实时监测细胞分化的方法包括：
128.将所述磁共振生物影像纳米探针经体外标记进入细胞，获得标记细胞；
129.将所述标记细胞移植到人或动物体内；
130.将含有所述标记细胞的人或动物置于磁共振成像设备中，采集含有所述标记细胞及其周边组织的t2加权像，所述标记细胞在所述t2加权像呈现暗信号；
131.将所述标记细胞诱导分化为目标子代细胞；
132.所述标记细胞分化为目标子代细胞过程中过表达所述特异性酶；
133.所述特异性酶催化切割所述酶底物，所述磁共振影像纳米探针降解为探针基本单元并从细胞逸出；可选地，所述特异性酶进一步切割偶联磁共振探针分子的酶底物，释放磁共振探针分子并从细胞逸出；
134.所述从细胞中逸出的磁共振探针基本单元或探针分子，向周边组织扩散；
135.将含有所述标记细胞的人或动物置于磁共振成像设备中，采集含有所述标记细胞及其周边组织的t2加权像；
136.扩散到周边组织中的磁共振探针基本单元或探针分子诱导所述标记细胞的周边组织在所述t2加权像呈现亮信号，从而报告细胞分化的过程或结果。
137.本发明实施例的另一个方面还提供了一种生物成像方法，所述方法是非医学诊疗目的的，其包括：
138.以前述的生物影像纳米探针标记细胞，之后将经过标记的细胞移植到生物体内，然后通过磁共振成像系统或者荧光成像系统实现生物成像。
139.本发明实施例的另一个方面还提供了一种产品，应用于实时监测细胞属性变化，所述产品包括前述的生物影像纳米探针。
140.进一步地，所述产品的纯度在90％以上。
141.下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
142.下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
143.实施例1
144.β-cd接枝马来酸、再偶联马来酰亚胺的生物影像探针单元中间体合成：
145.三颈瓶中加入nah(1.8g，45mmol)和无水dmf(10ml)，搅拌溶解。称取β-cd(1g，0.88mmol，1h nmr谱参见图2-1)溶解于dmf(10ml)中。溶解完全后，滴加到三颈瓶nah溶液中，搅拌5min。在冰浴和n2保护下把马来酸酐(3.7ml，45mmol)缓慢滴加至三颈瓶混合溶液中。滴加完全后，转移到室温搅拌8h。200kda透析三天冻干，得到白色固体产物(β-cd-mam)。将适量产物溶于d2o中，测量1h nmr谱(如图2中2)。谱中出现马来酸中的烯烃氢特征峰，从其与β-cd的特征峰面积比估算，每个β-cd表面接枝上了m≈6个马来酸(ma)。
146.称取68mg β-cd-mam置于10ml水中溶解完全，0℃下加入400mg edc、500mg nhss于上述溶液中，搅拌15min溶解。加入1g n-(3-aminopropyl)-3-(2，5-dioxo-2，5-dihydro-1h-pyrrol-1-yl)propanamide水溶液，并迅速用0.1m的氢氧化钠调节ph＝7，转移到室温搅拌12h。500kda透析三天冻干，得到橙色固体产物(β-cd-ma
m-maln)。将适量产物溶于d2o中，测量1h nmr谱(如图2中3)。谱中烯烃氢特征峰的面积进一步增加，从其与β-cd中特征峰面积比估算，每个β-cd表面接枝上了n≈3个马来酰亚胺(mal)。
147.称取5mg β-cd-ma
m-maln于0.6mld2o中，超声溶解完全后，再称取3.6mg半胱氨酸甲酯盐酸盐(cys-ome
·
hcl)加入溶液中，超声反应半个小时后，测量1h nmr谱(如图2中4)。与β-cd-ma
m-maln谱图对比，烯烃氢特征峰全部消失，表明半胱氨酸甲酯中的巯基与β-cd外表面接枝的马来酸和马来酰亚胺中的烯烃双键能够发生点击加成化学反应。
148.实施例2
149.β-cd内嵌1，4-二马来酰亚胺基苯点击化学组装通用纳米平台
150.称取β-cd 50mg置于50ml的圆底烧瓶中，加入10ml水搅拌溶解。称取1，4-二马来酰亚胺基苯(mal-ph-mal)18mg置于30ml甲醇中搅拌溶解。60℃下剧烈搅拌，将1，4-二马来酰亚胺基苯的甲醇溶液缓慢滴加到β-cd水溶液中。滴加完全后，反应14h；除去溶剂中多余的甲醇，过滤除去不溶物，冻干24h得到1，4-二马来酰亚胺基苯的β-cd包合物(mal-ph-mal@β-cd)。将适量产物溶于d2o中，测量1h nmr谱(图3-3)。谱中除了出现β-cd的系列特征峰外，在～7.4ppm和～6.85ppm出现mal-ph-mal中苯环氢和马来酰亚胺烯烃氢的特征峰。因为1，4-二马来酰亚胺基苯不溶于水，其在d2o中1h nmr谱无谱峰出现(图3-1)，因此结果表明1，4-二马来酰亚胺基苯成功嵌入到β-cd中。
151.称取10mg上述包合物置于0.6ml d2o中超声溶解完全；称取6mg cys-ome
·
hcl加入溶液中，超声反应30min后，测量1h nmr谱(图3-4)。与mal-ph-mal@β-cd谱图对比，烯烃氢特征峰消失，表明半胱氨酸甲酯中的巯基与β-cd内嵌的mal-ph-mal中的烯烃双键能够发生点击加成化学反应。同时，mal-ph-mal与cys-ome在有机相中反应后产物可以微溶于d2o，其1h nmr谱(图3-2)中苯环氢的化学位移相对于mal-ph-mal@β-cd与cys-ome
·
hcl反应后的苯环氢偏移了～0.1ppm，表明反应过程中mal-ph-mal未从β-cd逸出。
152.实施例2的结果说明：可以成功地把1，4-双马来酰亚胺塞进入到环糊精空腔里，为后续和巯基偶联反应形成纳米尺寸的探针奠定基础。
153.实施例3
154.β-cd接枝abz、内嵌1，4-二马来酰亚胺基苯点击化学合成荧光影像探针(图4)
155.称取50mg实施例1中的β-cd-ma
m-maln置于10ml水中超声完全溶解，加入55mg methyl 2-(2-aminobenzamido)-3-mercaptopropanoate(abz-cys-ome)，并迅速用0.1m的氢氧化钠调节ph＝7，超声反应30min，将荧光基团abz接枝到β-cd外表面。取部分反应液，稀释成浓度为10μm溶液。取1ml溶液置于石英玻璃皿中，利用荧光分光光度计测量荧光强度(图4-1)，激发波长320nm，检测发射波长340～600nm，激发和发射狭缝宽度10nm，光电倍增管激发电压500v。结果表明，接枝到β-cd外表面的abz保持了其荧光性质。
156.称取1，4-二马来酰亚胺基苯18mg置于30ml甲醇中搅拌溶解。60℃下剧烈搅拌，将1，4-二马来酰亚胺基苯的甲醇溶液缓慢滴加到上述水溶液中。滴加完全后，反应14h；除去溶剂中多余的甲醇，过滤除去不溶物。取部分反应液，稀释成浓度为10μm溶液。取1ml溶液置于石英玻璃皿中，利用荧光分光光度计测量荧光强度(图4-2)，测量条件同上。结果表明，产物的荧光强度与接枝到β-cd表面的abz相比显著降低，这主要因为1，4-二马来酰亚胺基苯能够吸收abz发射的荧光，嵌入到β-cd内腔后起到了分子内荧光淬灭的作用。
157.称取20mg cys-ome
·
hcl加入上述反应液中，超声反应30min。取部分反应液，稀释成浓度为10μm溶液。取1ml溶液置于石英玻璃皿中，利用荧光分光光度计测量荧光强度(图4-3)，测量条件同上。结果表明，产物的荧光强度又恢复到了接枝到β-cd表面的abz的～70％，表明1，4-二马来酰亚胺基苯中的烯烃双键与半胱氨酸甲酯中巯基发生了点击加成化学反应，导致其失去吸收abz荧光的功能，从而观察到荧光恢复现象。
158.实施例4：采用实施例3中的β-cd接枝组装的酶响应荧光纳米探针报告hl60细胞定向分化
159.将冻存在液氮里的人原髓细胞白血病细胞(hl60)取出，在37℃水浴中迅速解冻。在超净台中，用1ml移液枪将解冻后细胞的冻存液取出并置于10ml灭菌离心管中，同时加入2ml完全培养基(imdm 80％～90％，澳洲胎牛血清10％～20％，双抗1％)，1000r/min离心5min，吸去培养基。加3ml完全培养基于离心管中，将细胞沉淀吹散，取出细胞悬液，置于100
×
20mm培养皿中，继续加入5ml完全培养基，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分散于完全培养基中。将含细胞的培养皿放入37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养。细胞复苏第二天，更换培养基，继续培养。当贴壁细胞密度达到80％～90％，吸去培养基。用2ml无菌pbs溶液轻轻洗涤长满细胞的培养皿，再加入1ml pbs和1ml胰酶，显微镜下及时观察细胞形态。待细胞消化完全后，吸去胰酶，用含4ml完全培养基吹打细胞，一分为二转移至两个100
×
20mm培养皿中，再分别加入6ml完全培养基继续培养。
160.细胞处理：当贴壁细胞密度达到80％～90％时，用2ml无菌pbs溶液轻轻洗涤长满细胞的培养皿，再加入1ml pbs和1ml胰酶，显微镜下及时观察细胞形态。待细胞消化完全后，吸去胰酶。用4ml完全培养基吹打细胞，将细胞悬液转移至10ml灭菌离心管，1000r/min离心5min，吸去培养基得到细胞沉淀。再用4ml pbs进行同样的重悬操作。
161.孵育标记细胞：100
×
20mm细胞培养皿中接种的hl60细胞培养2天后，每皿密度约为1
×
106个细胞，将实施例3制备的β-cd荧光影像纳米探针加入细胞培养皿中至终浓度为50μm，继续共孵育24h。细胞标记完成后，用2～3ml pbs冲洗细胞三次，以去除残留的材料。然后将细胞分为三组，转移到6孔板内。其中一组在imdm完全培养基中加入48nm tpa，诱导荧光纳米探针标记的hl60向巨噬细胞分化；另外一组在imdm完全培养基中加入1.25％
dmso，诱导荧光纳米探针标记的hl60向中性粒细胞分化；最后一组作为对照，仅加入imdm完全培养基正常培养。在不同的时间点，使用宽波段荧光显微镜对细胞进行显微荧光成像。如图5所示，结果表明，两天后对照组和中性粒细胞分化组的荧光强度明显强于巨噬细胞分化组，原因是分化为巨噬细胞过程中，过表达的组织蛋白酶b将β-cd荧光影像纳米探针降解后，后者逸出细胞并随细胞培养基清除，导致细胞荧光强度降低。
162.实施例5：β-cd接枝dota、内嵌1，3-二马来酰亚胺基丙烷点击化学构建酶响应磁共振影像纳米探针前体
163.称取20mg多肽-探针络合剂cfrfk(k)-(dota)2，配制成浓度为1.1mm水溶液；称取20mg β-cd-ma
m-maln，配制成浓度为7.8mm水溶液。在5ml离心管中加入1.1mm多肽-探针络合剂cfrfk(k)-(dota)2水溶液1ml，加入7.8mm β-cd-ma
m-maln水溶液14μl，在75℃水浴中反应2h后，转移到室温下搅拌反应12h，得到β-cd磁共振影像探针基本单元前体(记为β-cd～cfrfk(k)-(dota)2)。取适量产物溶于d2o中，测量1h nmr谱(如图6中2)。与β-cd-ma
m-maln的1h nmr谱(如图6中1)相比，在～7.2ppm处出现多肽frfk中苯环氢的特征峰，表明cfrfk(k)-(dota)2中巯基与β-cd-ma
m-maln中烯烃双键发生了点击加成化学反应，成功将cfrfk(k)-(dota)2接枝到β-cd表面。
164.将上述反应完成的β-cd～cfrfk(k)-(dota)2溶液加水稀释到10ml。称取10mg 1，3-二马来酰亚胺基丙烷，置于20ml甲醇中搅拌溶解完全。在60℃剧烈搅拌下，把甲醇溶液缓慢滴加到β-cd～cfrfk(k)-(dota)2水溶液中，滴加完全后，60℃下反应12h。除去溶剂中残留的甲醇，过滤除去不溶物，冻干24h后得到包合产物。取适量产物溶于d2o中，测量1h nmr谱(如图6中3)。谱中在～6.75ppm处出现马来酰亚胺中的烯烃氢特征峰，表明1，3-二马来酰亚胺基丙烷成功嵌入到β-cd内腔中。
165.取上述包合产物10mg溶于0.6ml d2o中，超声溶解完全后，加入2mg cys-ome
·
hcl，室温条件下反应12h，测量1h nmr谱(如图6中4)。谱中～6.75ppm处马来酰亚胺的烯烃氢特征峰强度显著降低，表明半胱氨酸甲酯中巯基与β-cd内嵌的1，3-二马来酰亚胺基丙烷的烯烃双键能够发生点击加成化学反应，这是共价组装酶响应磁共振影像纳米探针的必要条件。
166.实施例6：β-cd接枝组装的酶响应磁共振影像纳米探针构建及在报告hl60细胞定向分化中应用
167.称取20mg多肽-探针络合剂cfrfk(k)-(dota)2，配制成浓度为1.1mm水溶液；滴加等摩尔量的gdcl3溶液制备成多肽-磁共振探针cfrfk(k)-(dota-gd)2溶液，滴加过程中控制溶液ph值。称取20mg β-cd-ma
m-maln，配制成浓度为7.8mm水溶液。往cfrfk(k)-(dota-gd)2溶液中加入7.8mm β-cd-ma
m-maln水溶液14μl，75℃水浴中反应2h后，室温下反应12h，得到组织蛋白酶b响应的β-cd磁共振影像探针基本单元，定容到10ml。
168.称取10mg 1，4-二马来酰亚胺基苯，置于20ml甲醇中搅拌溶解完全。60℃剧烈搅拌下，将1，4-二马来酰亚胺基苯的甲醇溶液缓慢滴加到上述探针基本单元的10ml水溶液中。滴加完全后，60℃下反应12h。反应完全后，加入5mm多肽cfrfk(c)水溶液30μl，室温条件下反应12h，得到β-cd接枝组装的酶响应磁共振影像纳米探针。
169.将冻存在液氮里的人原髓细胞白血病细胞(hl60)取出，在37℃水浴中迅速解冻。在超净台中，用1ml移液枪将解冻后细胞的冻存液取出并置于10ml灭菌离心管中，同时加入
2ml完全培养基(imdm 80％～90％，澳洲胎牛血清10％～20％，双抗1％)，1000r/min离心5min，吸去培养基。加3ml完全培养基于离心管中，将细胞沉淀吹散，取出细胞悬液，置于100
×
20mm培养皿中，继续加入5ml完全培养基，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分散于完全培养基中。将含细胞的培养皿放入37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养。细胞复苏第二天，更换培养基，继续培养。当贴壁细胞密度达到80％～90％，吸去培养基。用2ml无菌pbs溶液轻轻洗涤长满细胞的培养皿，再加入1ml pbs和1ml胰酶，显微镜下及时观察细胞形态。待细胞消化完全后，吸去胰酶，用含4ml完全培养基吹打细胞，一分为二转移至两个100
×
20mm培养皿中，再分别加入6ml完全培养基继续培养。
170.细胞处理：当贴壁细胞密度达到80％～90％时，用2ml无菌pbs溶液轻轻洗涤长满细胞的培养皿，再加入1ml pbs和1ml胰酶，显微镜下及时观察细胞形态。待细胞消化完全后，吸去胰酶。用4ml完全培养基吹打细胞，将细胞悬液转移至10ml灭菌离心管，1000r/min离心5min，吸去培养基得到细胞沉淀。再用4ml pbs进行同样的重悬操作。
171.孵育标记细胞：100
×
20mm细胞培养皿中接种的hl60细胞培养2天后，每皿密度约为1
×
106个细胞。将上述合成的酶响应磁共振影像纳米探针加入细胞培养皿中至终浓度为200μm，继续共孵育24h。细胞标记完成后，用2～3ml pbs冲洗细胞三次，以去除残留的材料。然后将细胞分为两组，其中一组在imdm完全培养基中加入48nm tpa，诱导荧光纳米探针标记的hl60向巨噬细胞分化；另外一组作为对照，仅加入imdm完全培养基正常培养。继续共孵育24h后收集并清洗细胞，获得细胞沉淀。
172.取4～6周龄的blalb/c裸鼠，称重并记录，随后用5％水合氯醛按5ml/kg的体重浓度进行麻醉处理。将处于麻醉状态的裸鼠，用75％酒精擦拭头部皮肤，用无菌刀片沿中轴线切约1cm长的伤口，剪开筋膜，找到前囱的位置。以前囱为原点，向后2cm，向右1.5cm，用直径为1mm的颅钻钻开头骨。随后用微量注射泵在向下2mm的位置注射标记的细胞。注射速度为0.5μl/min，注射完成后停针5min后缓慢将微量注射器拔出。标记的细胞移植完成后，缝合伤口，并立即于11.7t小动物mri成像仪上测定其t2加权像。裸鼠每隔两天采集一次t2加权像(图7)，观测t2加权像的信号变化，直至观测不到标记细胞后结束实验。
173.从图7中可以看到，移植的未分化细胞在活体中一直呈现暗信号；处于分化为巨噬细胞过程中的移植细胞在活体中亦呈现暗信号，但在其周边组织中呈现显著的亮信号，原因是分化为巨噬细胞过程中过表达的组织蛋白酶b将β-cd磁共振影像纳米探针降解为小分子探针后逸出细胞，并向周边组织扩散，从而诱导周边组织呈现mri亮信号，提供了细胞分化过程和结果的明确影像学信息。
174.此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
175.应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种生物影像探针单元的制备方法，其特征在于，包括：通过点击化学反应将活性基团a接枝于环糊精分子表面；其中，所述活性基团a包括烯基和/或炔基；将影像探针分子与活性基团b偶联，之后使活性基团b与接枝于环糊精分子表面的活性基团a进行点击化学反应，从而将影像探针分子接枝于环糊精分子表面，制得生物影像探针单元；其中，所述活性基团b包括巯基官能团。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括：将影像探针分子通过第一酶底物与活性基团b偶联，之后使活性基团b与接枝于环糊精分子表面的活性基团a进行点击化学反应，从而制得酶响应的生物影像探针单元。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述环糊精包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精中的任意一种或多种的组合，优选为β-环糊精；和/或，所述活性基团a的来源包括含烯基和/或炔基官能团的化合物；和/或，所述活性基团b的来源包括硫醇和/或半胱氨酸；和/或，所述第一酶底物包括多肽底物；优选的，所述多肽底物包括含有frfk结构的多肽和/或含有devd结构的多肽；和/或，所述影像探针分子包括磁共振影像探针分子和/或荧光影像探针分子；优选的，所述磁共振影像探针分子包括gd基络合物探针；优选的，所述荧光影像探针分子包括分子内淬灭荧光探针。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：使溴丙烯在碱催化下通过成醚反应接枝丙烯，获得含所述活性基团a的化合物；或者，使溴丙基马来酰亚胺在碱催化下通过成醚反应接枝马来酰亚胺，获得含所述活性基团a的化合物；或者，使马来酸酐在碱催化下通过成酯反应接枝马来酸，获得含所述活性基团a的化合物；或者，使马来酸酐在碱催化下通过成酯反应接枝马来酸，再与氨基马来酰亚胺反应，并通过生成酰胺键接枝马来酰亚胺，获得含所述活性基团a的化合物。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括：使环糊精与含所述活性基团a的化合物发生接枝反应，从而获得表面接枝有所述活性基团a的环糊精。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括：在第一酶底物的两端分别偶联磁共振影像探针分子和活性基团b，之后与表面接枝有所述活性基团a的环糊精反应，获得生物影像探针单元；优选的，所述磁共振影像探针分子包括磁共振造影单元，所述磁共振造影单元包括超顺磁金属络合物，所述超顺磁金属络合物由超顺磁金属和络合剂组成；和/或，所述制备方法具体包括：在第一酶底物的两端分别偶联荧光影像探针分子和活性基团b，之与表面接枝有活性基团a的环糊精反应，从而获得生物影像探针单元；优选的，所述荧光影像探针分子包括邻氨基苯甲酰；优选的，所述制备方法还包括：将荧光淬灭基团通过第一酶底物与所述荧光影像探针分子连接；其中，所述荧光淬灭基团包括2，4-二硝基苯撑。7.由权利要求1-6中任一项所述的制备方法制得的生物影像探针单元。
8.一种生物影像纳米探针的制备方法，其特征在于，包括：采用权利要求1-6中任一项所述的方法制备生物影像探针单元，之后将活性基团c置入所述生物影像探针单元中的环糊精分子内腔，然后使活性基团c与活性基团d进行点击化学反应，以将至少两个所述生物影像探针单元相互连接，从而制得生物影像纳米探针；其中，所述活性基团c具有至少两个第一活性位点，所述活性基团d具有至少两个第二活性位点，每一第一活性位点能与相应一第二活性位点进行点击化学反应。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，具体包括：在第二酶底物上偶联至少两个活性基团d，然后使所述活性基团d与嵌入环糊精分子内腔的活性基团c进行点击化学反应，以将至少两个所述生物影像探针单元相互连接，从而制得酶响应的生物影像纳米探针。10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述活性基团c的来源包括烷基、芳香环或芳香杂环偶联的烯烃和/或烷基、芳香环或芳香杂环偶联的炔烃；优选的，所述活性基团c的来源包括偶联双炔基化合物、双马来酰亚胺化合物、双丙烯酸酯化合物中的任意一种或多种的组合；优选的，所述活性基团c的来源包括对二乙炔苯、4，4
′‑
二乙炔联苯、1，3-二马来酰亚胺基丙烷、1，4-二马来酰亚胺基苯、1，4-二丙烯酸亚苯酯、4，4
′‑
二丙烯酸联苯酯中的任意一种或多种的组合；和/或，所述第二酶底物包括两端含有两个半胱氨酸的多肽片段；和/或，所述活性基团d的来源包括含两个以上硫醇和/或半胱氨酸的有机化合物。11.由权利要求8-10中任一项所述的制备方法制得的生物影像纳米探针；优选的，所述生物影像纳米探针包括磁共振生物影像纳米探针和/或荧光生物影像纳米探针。12.权利要求7所述的生物影像探针单元或权利要求11所述的生物影像纳米探针在活体细胞示踪领域中的用途。13.一种实时监测细胞属性变化的方法，其特征在于，包括：提供权利要求11所述的生物影像纳米探针；以所述生物影像纳米探针标记细胞，之后将经过标记的细胞诱导分化为目标子代细胞，所述诱导分化过程中产生的特异性酶能够催化切割所述生物影像纳米探针中的酶底物，之后通过磁共振成像系统或者荧光成像系统进行监测，从而实现对细胞分化的过程或结果的实时监测。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述细胞包括hl60细胞和/或hmscs；和/或，所述特异性酶包括catb酶和/或caspase 3酶。15.一种生物成像方法，所述方法是非医学诊疗目的的，其特征在于，包括：以权利要求11所述的生物影像纳米探针标记细胞，之后将经过标记的细胞移植到生物体内，然后通过磁共振成像系统或者荧光成像系统实现生物成像。16.一种产品，应用于实时监测细胞属性变化，其特征在于，所述产品包括权利要求11所述的生物影像纳米探针；优选的，所述产品的纯度在90％以上。

技术总结
本发明公开了一种生物影像探针单元、生物影像纳米探针及制备方法与应用。所述生物影像探针单元的制备方法包括：通过点击化学反应将活性基团A接枝于环糊精分子表面；其中，所述活性基团A包括烯基和/或炔基；将影像探针分子与活性基团B偶联，之后使活性基团B与接枝于环糊精分子表面的活性基团A进行点击化学反应，从而将影像探针分子接枝于环糊精分子表面，制得生物影像探针单元；其中，所述活性基团B包括巯基官能团。本发明中的生物影像纳米探针可以用于报告组织和细胞中特定酶的活性，从而可以用于报告细胞的特定生理过程；同时该探针具有较好的通用性，可以得到报告不同酶生理活性的纳米探针，具有广泛的用途。具有广泛的用途。具有广泛的用途。


技术研发人员：邓宗武 李孟娟 张艳辉 谭波 张海禄
受保护的技术使用者：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/10/11