柚皮素的应用

1.本发明涉及药物新应用技术领域，具体而言，涉及柚皮素的应用。


背景技术：

2.g蛋白耦联雌激素受体(下文也称为gper)是一种g蛋白偶联受体家族的新型雌激素受体，可与雌二醇等雌激素结合，但其信号途径及作用机制与经典核雌激素受体(erα和erβ)不同，是一种既能够介导非基因型快速反应也可通过第二信使系统发挥间接转录调控作用的膜性受体。gper在不同组织中都有重要作用，因此gper调节剂有望作为多种与gper相关疾病药物开发。但gper调节剂鲜有成药性佳的候选药物报。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供柚皮素的应用。本发明实施例发现柚皮素可以调节g蛋白偶联雌激素受体(gper)，继而可以对乳腺癌特别是三阴性乳腺癌具有良好的治疗效果。
5.本发明是这样实现的：
6.第一方面，本发明提供一种柚皮素在制备调控g蛋白偶联雌激素受体的调节剂中的应用。
7.第二方面，本发明提供一种柚皮素在制备治疗g蛋白偶联雌激素受体介导的疾病的药物中的应用。
8.在可选的实施方式中，所述g蛋白偶联雌激素受体介导的疾病包括三阴性乳腺癌。
9.在可选的实施方式中，所述药物包括能降低肿瘤体积和/或重量的药物。
10.在可选的实施方式中，所述药物包括能对肿瘤组织产生破坏作用的药物。
11.在可选的实施方式中，所述药物包括能诱导肿瘤细胞凋亡的药物。
12.在可选的实施方式中，所述药物包括能够诱导caspase-3的表达的药物。
13.在可选的实施方式中，所述药物包括上调bax/bcl-2的表达比例的药物。
14.第三方面，本发明提供一种柚皮素在制备抑制g蛋白偶联雌激素受体的gper抑制剂中的应用。
15.第四方面，本发明提供一种柚皮素在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
16.第五方面，本发明提供一种柚皮素作为唯一活性成分在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
17.本发明具有以下有益效果：本发明实施例特别地发现柚皮素能够靶向调控gper，并对三阴性乳腺癌有良好的治疗效果，本发明实施例提供的柚皮素的新应用，不仅仅扩大了柚皮素的使用范围，还为gper调节剂以及治疗三阴性乳腺癌的药物提供更多的选择。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附
图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
19.图1为本发明实验例1提供的分子对接的结果图；
20.图2为本发明实验例2提供的细胞热转移实验的结果图；
21.图3为本发明实验例3提供的细胞实验的结果图；
22.图4为本发明实验例4提供的柚皮素在体内的抗肿瘤活性，肿瘤体积及肿瘤重量的结果图；
23.图5为本发明实验例5提供的肿瘤组织的he染色结果图；
24.图6为本发明实验例6提供的tunel染色结果图；
25.图7为本发明实验例7提供的免疫组化结果图。
具体实施方式
26.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
27.柚皮素(naringenin)是柚皮甙的甙元，属二氢黄酮类化合物，其中，柚皮素的结构式如下所示：具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗肿瘤、解痉和利胆、预防和治疗肝病、抑制血小板凝结、抗粥样动脉硬化等作用，可被广泛地应用于医药、食品等领域。柚皮素能治疗癌症的主要原因是其可以增强机体免疫功能，调节机体t淋巴细胞水平，修复由于肿瘤或者放疗、化疗引起的继发性免疫缺陷，增强杀伤癌细胞的作用，也就是说柚皮素通过能增强机体的免疫功能，调动本身内在的抗癌能力。
28.三阴性乳腺癌(tnbc)是指雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)和人表皮生长因子受体(her2)均阴性的一种特殊类型乳腺癌。现有技术中能够治疗三阴性乳腺癌的药物极少。
29.而本发明实施例发现柚皮素可以作为gper调节剂，特别是通过与gper结合对三阴性乳腺癌产生良好的治疗效果。
30.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
31.实验例1
32.通过autodocktools-1.5.7软件模拟g蛋白偶联雌激素受体(gprotein-coupled estrogen receptor1,gper)激动剂：g-1(lns 8801)对接gpr30，结果参见表1和图1中a，根据表1可知，g-1与该蛋白有良好的亲合力(结合能为-6.81)。而后采用与g-1相同的设置和参数将柚皮素与gpr30对接，评估柚皮素与gpr30配体的对接能力。结果参见表1和图1中b。
根据图1中b和表1可知，柚皮素定位在gpr30结合位点内(图1中b)，显示出对gpr30的良好亲和力。测得其结合能为-4.38kcal/mol(《-1.2kcal/mol)，对接结果良好。在gpr30模型中，柚皮素与gpr30的lbd在asn-118、his-308、his300 197位点形成氢键(图1中b)，形成稳定的结合。
33.表1g-1、柚皮素与gpr30的结合能
[0034][0035]
实验例2
[0036]
细胞热转移实验
[0037]
细胞热转移实验是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，随着温度的升高，蛋白会发生降解。当目标靶蛋白受体与药物分子结合后，其蛋白的热稳定性会发生变化。当蛋白与药物结合后，与没有与药物结合的蛋白相比，在相同温度下，蛋白的降解量会不同，可以通过western blot手段检测。具体过程如下：
[0038]
配制含有柚皮素的细胞培养基。首先取1mg柚皮素溶解在1ml的细胞培养级dmso中，制作浓度为1mg/ml的柚皮素母液，柚皮素母液用0.22μm的无菌滤头过滤除菌。分别将柚皮素母液稀释在4t1细胞专用培养基，调整柚皮素在培养基中的最终浓度。
[0039]
其中，4t1细胞分组为：柚皮素组和control组。
[0040]
分别接种在t75培养瓶中，放于5％ co2、37℃细胞培养箱中培养24h后，在显微镜下观察细胞的生长情况。当细胞密度长至50％-60％,柚皮素组培养瓶使用移液器吸去旧培养基，用10ml无菌巴氏吸管轻柔加入20ml柚皮素培养基，control组组细胞不做处理，继续放入培养箱培养大约24h，当control组细胞密度达到90％时，进行全蛋白提取。
[0041]
取32只0.2ml薄壁管，按照表2蛋白样品分组分别进行标号，将tc、mc、mn、tn组的细胞裂解液，分装至薄壁管中，每只100μl。
[0042]
对照表2蛋白样品分组所示温度梯度，设置金属浴的温度，对蛋白裂解液进行加热，每组温度加热5min，常温冷却3min。
[0043]
表2蛋白样品分组
[0044][0045]
提前4℃预冷低温高速离心机，将处理好的蛋白裂解液12000rpm下离心5min，收集上清液。
[0046]
根据酶标仪在a562nm测不同孔的吸光度，记录标准品和样品的吸光值数据，根据标准品测量数据绘制标准曲线，生成函数公式，将样品数据套入公式，参照样本体积计算各组蛋白样本的蛋白浓度。
[0047]
再制备上样蛋白样品、sds-page；再插梳子、拔梳子、上样、电泳、转膜、封闭、孵育
抗体和显影。
[0048]
结果参见图2，其中，图2中a为表达量变化的结果图，图2中b为相对结合律的结果图，根据图2可知，随着温度的升高，gpr30蛋白的表达量逐渐减少，蛋白发生降解，从50℃开始柚皮素组gpr30的表达量远远高于同温度下的control组，在55℃时，control组的gpr30蛋白已经全部降解，而柚皮素处理组的gpr30蛋白一直到75℃时仍然有表达，说明柚皮素提高了gpr30的热稳定性，柚皮素和三阴性乳腺癌4t1细胞中gpr30之间存在直接相互作用，gpr30可能是柚皮素的作用靶点。
[0049]
实验例3
[0050]
细胞实验：通过cck-8实验测定柚皮素对4t1细胞和mcf-7细胞的抑制效果
[0051]
(1)实验分组
[0052]
t组：4t1细胞；m组：mcf-7细胞，其中，具体分组以及加药如下：
[0053]
t1组：加药处理24h，分组加药见下表。
[0054][0055]
t2组：加药处理48h，分组加药见下表。
[0056][0057]
m1组：加药处理24h，分组加药见下表。
[0058][0059]
m2组：加药处理48h，分组加药见下表。
[0060][0061]
具体操作如下：
[0062]
4t1、mcf-7细胞胰酶消化后计数，取部分含细胞的培养基，离心重悬使细胞浓度为50000/ml。在96孔板中接种4t1细胞悬液和mcf-7细胞悬液(100ul/孔，每孔约5000个细胞)，每样6个重复，分组为t1、t2、m1、m2。细胞培养24小时，使4t1、mcf-7细胞贴壁。t1、t2、m1、m2
参照上述分组给药方式进行给药以及培养。
[0063]
而后每孔加入10ul cck-8溶液，再在细胞培养箱内继续孵育2小时。接着，用酶标仪测定在450nm处的吸光值(optical density，od)。
[0064]
实验结果分析：
[0065]
抑制率＝[od(0加药)-od(药物)]/[od(0加药)-od(空白)]
×
100％
[0066]
od(药物)：具有细胞、培养基、cck-8溶液和柚皮素溶液的孔的吸光值
[0067]
od(空白)：具有培养基、cck-8溶液，没有细胞的孔的吸光值
[0068]
od(0加药)：具有细胞、培养基、cck-8溶液，没有柚皮素溶液的孔的吸光值。
[0069]
结果参见图3，根据图3可知，用不同浓度的柚皮素处理mcf-7细胞和4t1细胞，柚皮素呈明显的剂量依赖性抑制4t1细胞增殖，在500μg/ml与250μg/ml浓度下对4t1细胞的抑制率接近100％。通过spss软件计算得出，柚皮素抑制4t1细胞的ic
50
值分别是146μg/ml(24h)和120μg/ml(48h)(图3中a和b)，柚皮素抑制mcf-7细胞的ic
50
值分别是592μg/ml(24h)和465μg/ml(48h)(图3中c和d)。以上结果表示，柚皮素对于mcf-7细胞增殖的抑制作用是受限的，然而柚皮素对4t1细胞具有较高的抑制效率，由此可见柚皮素有可能是一种潜在的抗乳腺癌药物，可能通过影响mcf-7与4t1细胞系的共同靶点而发挥作用，且对4t1细胞增殖有更好的抑制效果。研究表明，gpr30在mcf-7与4t1细胞中普遍表达，且呈正相关影响肿瘤进程。
[0070]
实验例4
[0071]
动物实验
[0072]
造模：balb/c小鼠，雌性，6-8周龄，体重16-18g，共18只，购买自华阜康动物实验公司，用无菌注射器抽取0.1ml(1
×
107个)上述浓度的4t1乳腺癌细胞，接种于balb/c小鼠乳房脂肪垫(需要麻醉手术，注射到乳房下，缝针后约3-5天恢复，约5-7天可见明显肿瘤凸起)，建立4t1乳腺癌原位荷瘤小鼠模型。荷瘤小鼠继续在无菌环境下饲养一周，当肿瘤凸起直径达5mm后，将小鼠分组分笼，小鼠随机分为三组，每组6只，分养到三只笼内，按标记设计对小鼠进行标记编号。
[0073]
分组：采用生理盐水的control组，组号为c；采用柚皮素处理的药物处理组，组号为n；柚皮素+g-1给药治疗的恢复组，组号为g。对小鼠进行耳标标记，c组分别为c1-c6，标记符号为c1-c6；n组分别为n1-n6，标记符号为n1-n6；g组分别为g1-g6，标记符号为g1-g6。
[0074]
给药：c组灌胃给予空白溶剂，腹腔注射无菌生理盐水；n组灌胃给予柚皮素(使柚皮素终浓度为50mg/kg)，腹腔注射无菌生理盐水；g组灌胃给予柚皮素(使柚皮素终浓度为50mg/kg)，腹腔注射gpr30的特异性选择激动剂g-1(使g-1终浓度为3mg/kg)，给药时间设置为每天给药一次。
[0075]
给药期间开始进行肿瘤体积和生存期的测定。每天称量小鼠体重，记录小鼠生长状态，绘制生存曲线。肿瘤体积每2天测定一次。肿瘤体积的测定方式为：使用游标卡尺测量肿瘤的最短径和最长径，并采用以下公式进行计算：v＝a
×a×
b/2,a代表肿瘤体积的最短径，b代表肿瘤体积的最长径。
[0076]
给药2周后停止给药，21d后颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤组织，取心肝脾肺肾五脏。肿瘤称重，测量肿瘤大小并计算肿瘤体积。将肿瘤组织平均分成几份，分别用4％多聚甲醛(pfa)固定、石蜡包埋、以及液氮中保存以备后续研究。小鼠心肝脾肺肾4％的pfa固定，石蜡包埋。
[0077]
结果参见图4，其中图4为柚皮素在体内的抗肿瘤活性，肿瘤体积及肿瘤重量的结果图，c组为control组、n组为柚皮素治疗组、g组为gpr30功能回复组(与c组、g组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)，治疗后的离体肿瘤见图4中a，肿瘤重量见图4中b，肿瘤体积见图4中c。
[0078]
根据图4可知，(1)经过治疗，n组平均肿瘤重量为0.84
±
0.31g，与c组(1.44
±
0.21g)相比下降了42％左右(p《0.01)(图4中b)；最终肿瘤体积也有明显差异，c组肿瘤平均体积为1514
±
97mm3，柚皮素治疗组(760
±
292mm3)相比c组降低50％(p《0.01)左右(图4中c)。
[0079]
(2)经gpr30特异性激动剂g-1联合柚皮素治疗，gpr30功能回复后，g组平均肿瘤重量增长至1.50
±
0.30g(图4中b)，与n组相比呈明显升高；另外，g组肿瘤体积也显著增大，平均体积达到1424
±
49mm3(图4中c)，与n组相比呈明显增长。
[0080]
平均肿瘤体积数据用于证实柚皮素不仅在体外细胞实验可以取得治疗效果，在体内也是一个有效的肿瘤抑制剂；同时gpr30功能回复后抵消了柚皮素抑制肿瘤的作用，肿瘤体积与重量明显增加，模型小鼠的生存时间明显减少，表明gpr30可能是柚皮素抗三阴性乳腺癌的作用靶点，也说明柚皮素可以抑制gpr30，说明其可以作为gper抑制剂。
[0081]
实验例5
[0082]
he染色
[0083]
制作肿瘤组织he染色切片，考察肿瘤坏死情况，结果如图5所示。其中，c组肿瘤组织坏死情况见图5中a、n组肿瘤组织坏死情况见图5中b、g组肿瘤组织坏死情况见图5中c。
[0084]
根据图5可知，(1)c组肿瘤组织病理学变化，发现其细胞紧密。而在给药后，柚皮素使肿瘤组织细胞密度明显降低，导致出现大面积坏死区域。在坏死区中，细胞结构消失，核溶解，he染色呈红染。
[0085]
(2)加入gpr30激动剂g-1与柚皮素联合给药处理，gpr30功能回复使肿瘤组织细胞密度增加，坏死区域减少，细胞质与细胞核的形态结构相较与n组更加规整健康。
[0086]
根据以上变化，可以初步推断柚皮素给药后对体内肿瘤组织产生了破坏作用，而g-1与柚皮素联合给药后，柚皮素对肿瘤组织的破坏作用大大降低，这可能是因为gpr30功能恢复后，促进了肿瘤细胞的生长和修复，从而逆转了柚皮素对肿瘤的破坏作用。说明柚皮素通过下调gpr30功能促进肿瘤坏死，说明柚皮素能够抑制gper，继而治疗肿瘤。
[0087]
实验例6
[0088]
通过对每组肿瘤进行缺口末端核苷标记法(tunel)染色，进一步测定柚皮素在体内抗肿瘤的有效性，绿色tunel染凋亡细胞核，蓝色dapi染正常细胞核。
[0089]
结果参见图6，其中，c组tunel染色结果见图6中a、n组c组tunel染色结果见图6中b、g组c组tunel染色结果见图6中c，绿色tunel染凋亡细胞核，蓝色dapi染正常细胞核。
[0090]
根据图6可知，(1)与c组相较，柚皮素治疗组诱导更多的肿瘤细胞凋亡，n组肿瘤凋亡率最高，该肿瘤细胞凋亡数据进一步证明了柚皮素可能通过增加细胞凋亡来抑制肿瘤生长。
[0091]
(2)当gpr30的活性被激动剂上调后，柚皮素诱导肿瘤细胞凋亡的作用被抵消，g组染色结果多为蓝色，肿瘤细胞凋亡显著降低，这表明gpr30是柚皮素诱导肿瘤细胞凋亡的一个关键分子靶点。
[0092]
上述结果进一步说明柚皮素可抑制小鼠体内三阴性乳腺癌肿瘤细胞增殖，具有治疗三阴性乳腺癌的潜力，并且表明gpr30在柚皮素抗肿瘤作用中发挥了重要的作用。
[0093]
实验例7
[0094]
免疫组化
[0095]
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂来确定肿瘤组织内gpr30下游蛋白，对其进行定位、定性及定量。dab显色阳性应为棕黄色、棕色或棕褐色，而黄色的浅淡背景不应视为阳性。
[0096]
结果参见图7，4t1肿瘤组织切片ki-67、caspase 3、bax、bcl-2 ihc染色(与control组、g组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)，ki-67的蛋白表达结果与蛋白相对表达量见图7中a；caspase 3的蛋白表达结果与蛋白相对表达量见图7中b；bax的蛋白表达结果与蛋白相对表达量见图7中c；bcl-2的蛋白表达结果与蛋白相对表达量见图7中d。
[0097]
根据图7可知，(1)与c组相比，柚皮素给药组ki67表达明显受到抑制(p《0.001)(图7中a)，提示柚皮素能够有效抑制4t1细胞的增殖活性；bcl-2在各组中的表达如(图7中c)所示，c组中的bcl-2阳性面积大于n组(p《0.0001)；同时bax(p《0.1)与caspase-3(p《0.001)的表达趋势与bcl-2相反(图7中d和b)，与c组相比，n组呈高表达。
[0098]
(2)与n组相比，g组中ki67的呈高表达状态(图7中a)，这证明gpr30功能的回复促进了肿瘤细胞的增殖活性(p《0.001)；g组中的bcl-2(p《0.0001)的表达量显著大于n组(图7中b)；同时bax(p《0.1)与caspase-3(p《0.001)的表达趋势与bcl-2相反，与n组比较，g组bax与caspase-3蛋白的褐色阳性面积明显增加(图7中d和b)。
[0099]
bax为促凋亡亚家族成员，可以结合和调节抗凋亡的bcl-2蛋白以促进凋亡，caspase-3是细胞凋亡途径中最为关键的蛋白酶之一。n组结果可以证明柚皮素能够有效诱导caspase-3的表达，上调bax/bcl-2的表达比例，从而促进肿瘤细胞凋亡，减缓肿瘤发展进程。g组中肿瘤增殖活性的恢复，提示柚皮素通过抑制gpr30的功能参与抑制肿瘤细胞过程，也就是柚皮素可以抑制gper，继而治疗三阴性乳腺癌。
[0100]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种柚皮素在制备调控g蛋白偶联雌激素受体的gper调节剂中的应用。2.一种柚皮素在制备治疗g蛋白偶联雌激素受体介导的疾病的药物中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述g蛋白偶联雌激素受体介导的疾病包括三阴性乳腺癌。4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述药物包括能降低肿瘤体积和/或重量的药物。5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述药物包括能对肿瘤组织产生破坏作用的药物。6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述药物包括能诱导肿瘤细胞凋亡的药物。7.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述药物包括能够诱导caspase-3表达和/或上调bax/bcl-2的表达比例的药物。8.一种柚皮素在制备抑制g蛋白偶联雌激素受体的抑制剂中的应用。9.一种柚皮素在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。10.一种柚皮素作为唯一活性成分在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及药物新应用技术领域，具体而言，涉及柚皮素的应用。柚皮素在制备调控G蛋白偶联雌激素受体的GPER调节剂中的应用。本发明实施例发现柚皮素可以调控G蛋白偶联雌激素受体，继而对乳腺癌特别是三阴性乳腺癌具有良好的治疗效果。的治疗效果。的治疗效果。


技术研发人员：师健友 肖雯婧
受保护的技术使用者：四川省医学科学院
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/7/7